【必看】质谱仪如何校准

张明 0 2024-10-28

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LC-MS 校准的频率 (Calibration) 取决于所需的质量精度。例如，在对肽和蛋白质进行精确质量测量时，应每天对仪器校准进行验证。相反，小分子定量分析所需的校准频率较低。

质谱仪的一般校准方法

应通过注入校准溶液定期校准质量分析仪。一般使用电喷雾离子源 (ESI)。该溶液产生的离子（已知精确质量）应涵盖整个仪器的质量范围，或至少是用于后续分析的质量范围。

对于市场上最新的 LC-MS 来说，软件包中包含了一个自动程序，用于在 ESI 模式下进行调谐和校准。不过，较旧的仪器和/或非常特殊的应用仍需要手动或半自动程序来优化影响离子检测的参数。在 LC-MS 仪器中，质谱仪的调谐和校准分为三个步骤：

离子源和传输优化，
质谱校准
微调（最大限度地检测一个或多个特定离子）

离子源和传输优化

在此步骤中，以 5 μL/min 左右的稳定速率注入校准溶液，持续数分钟，从而在 ESI 模式下对 MS 的一个或多个特定离子进行大致调整。注入校准溶液化合物的最佳方法是使用大容量 Rheodyne 进样环（50 或 100 μL）或输液泵（如汉密尔顿注射泵）：

使用大容量注射流路时，溶剂输送系统应设置为以每分钟 5 μL 左右的速度将 50 : 50 的乙腈/水或 50 : 50 的甲醇/水通过注射器注入源。注射 50 μL 校准溶液将持续至少 10 分钟。使用输液泵时，应将校准溶液注入注射器，然后用熔融石英管或 peek 管连接至 ESI 喷针。

选择用于优化的离子应位于校准范围的中间或特定的相关区域（例如，咖啡因的 m/z = 195 或 PPG 校准溶液的 m/z = 906.7）。在使用自动调整程序证明进入质谱仪的离子传输达到最佳状态之前，应手动调整 ESI 源喷雾器，以建立进入质谱仪的稳定离子喷雾，并确保检测到足够的离子来校准质谱仪。

调整程度因型号而异，取决于喷射源的几何形状。一般来说，喷雾偏离入口轴线的源，如正交喷雾和 Z 向喷雾，所需的调整较少。对于同轴喷射源，为避免污染仪器光学元件，必须检查喷射源是否直接喷射到仪器孔口。轴上光源通常有一个侧窗，可以很好地观察喷射轨迹。在这两种情况下，喷雾器都应始终小幅度移动，直到达到所关注离子的最高信噪比值的最佳位置。离子源参数（如雾化器气体、透镜电压）可自动、半自动或手动优化。

质谱校准

第二步，使用校准溶液校准 ESI 模式的质谱仪。所有质量分析仪都必须进行校准。例如，三重四极杆质谱仪的一级四极杆和三级四极杆都要进行校准。以下是校准过程：

获取校准溶液的质谱数据（校准文件），并与存储在参考文件中的校准溶液峰预期质量表进行比对。
将参照文件中的每个质谱峰与校准文件中的相应质谱峰进行匹配。
校准文件中相应的匹配峰即为校准点。
通过校准点拟合校准曲线。
计算每个校准点与曲线的垂直距离。该距离代表校准后的质量残差。
同时计算残差的标准偏差。这个数字是校准精度的最佳单一指标。

在开始自动校准之前，需要设置一些质谱峰匹配参数。这些参数决定了获取的数据必须在哪个范围内，软件才能识别校准质量并成功校准。这些参数包括

质谱峰搜索范围。这是校准软件用于搜索最强质谱峰的窗口。增大该窗口会增加质谱峰匹配错误的几率。必须确保在质谱峰搜索范围内找到正确的质谱峰；否则，校准可能会出现偏差。如果定位到不正确的峰，则应调整搜索峰范围，以便只定位到正确的离子。
质谱峰阈值。校准程序中将不使用所获质谱中低于强度阈值（通常以质谱中最强峰的百分比来衡量）的所有峰。
质谱峰最大标准偏差或预测质量与实际质量之间的最大差值。在校准过程中，每对匹配质谱峰都会测量：校准文件中的测量质量与参考文件中的真实质量之间的差值。如果该值超过设定值，校准将失败。降低标准偏差值可获得更严格的限制，而增加标准偏差则意味着更容易满足要求，但这可能会导致质谱峰匹配不正确。
峰宽。这是一个用于设置分辨率的指标，通常规定为最大强度的 50%。

如果获取的质谱与参考质谱相似，且所有预期质谱峰都通过了上述标准，则校准可以接受。如果仪器以前从未校准过或以前的校准文件丢失，则必须使用更详细的校准程序。该校准程序要求从最低质量离子开始定位已知质谱峰。找到质谱峰后，将为离子的精确质量分配一个数模转换值。

一旦对仪器进行了全面校准，下次使用仪器时并不一定需要重复全面校准过程。可以通过注入校准溶液并将所有质谱峰匹配参数设置为全面校准时使用的值来执行校准验证，而不是全面校准。如果预测质量和实际质量之间的差异不大，则原始质量校准曲线仍然有效。无论仪器型号/品牌如何，在自动校准结束时都可以获得一份最终报告，其中显示校准溶液的预测精确质量、质谱中每个峰的实际质量、这两个质量之间的差值（校准精度），在许多情况下还会显示实验中指定的所有离子的强度和峰宽。

微调

第三步，对一个或多个特定离子的检测进行优化，以便在 ESI 或 APCI 模式下，利用相关分析物的标准品（如果有的话）对质谱进行调谐。可以选择相关分析物的质荷比 (m/z)，或者在没有分析物标准品的情况下，选择校准溶液中最接近相关离子质荷比的离子。

内容来源：仪器小知识

责任编辑：展源

审　　核：何发