如何判断qPCR数据能不能用？
1.扩增曲线：扩增曲线应该呈现出典型的 S 型曲线，且曲线应该平滑，没有明显的锯齿状或平台期。
如果 qPCR 数据满足以上要求，则可以认为数据可用。如果数据存在异常或不符合要求，则需要进一步分析原因并采取相应的措施，如优化实验条件、重新实验等。
内标未起线（无扩增）
病毒核酸检测中，多个样本的内源性内标（如RNase P）未出现扩增曲线。而阳性对照和阴性对照均正常，表明实验体系本身无重大问题。
原因分析
样本漏加或加样错误：在加样过程中可能存在漏加样本或加错样本的情况，导致这些样本的内标无法扩增。
采样管问题：采样管保存液变质，出现沉淀或液体变浑浊，影响样本质量，从而导致内标无法扩增。
提取步骤问题：提取过程中可能存在操作不当或试剂污染，导致提取的核酸质量不佳，无法用于后续扩增。
解决方案
检查加样步骤：回顾加样过程，确认是否有漏加或加错样本的情况。
更换采样管：使用质量可靠的采样管，并检查采样管保存液的状态，避免使用变质或污染的采样管。
优化提取步骤：确保提取过程中无抑制物残留，并使用高质量的提取试剂和耗材。
内标Ct值异常偏高
在QPCR实验中，部分样本的内标Ct值异常偏高，远高于正常值范围。这些样本的阳性靶标扩增曲线正常，但内标扩增效率明显偏低。
原因分析
样本中存在抑制物：样本中可能存在某些抑制物（如多糖、蛋白质等），这些抑制物会干扰PCR扩增反应，导致内标扩增效率降低。
提取不完全：核酸提取过程中可能存在提取不完全的情况，导致提取的核酸量不足，内标扩增效率降低。
引物问题：内标引物的设计或质量可能存在问题，如引物特异性不高、纯度不够等。
解决方案
样本稀释：将样本稀释后重新进行提取和扩增，以降低抑制物的影响。
优化提取方法：优化提取步骤，确保提取完全，并使用高质量的提取试剂和耗材。
更换引物：重新设计或选择高质量的内标引物，并验证实验以确认其特异性和扩增效率。
内标扩增曲线异常（非典型S型）
在QPCR实验中，部分样本的内标扩增曲线呈现非典型S型，如曲线不平滑、有波动或翘尾。
原因分析
温度控制不稳定：qPCR仪的温度控制可能存在不稳定的情况，导致扩增过程中温度波动较大，影响扩增曲线的形态。
反应体系污染：反应体系中可能存在污染物（如DNA片段、引物二聚体），导致非特异性扩增或扩增抑制。
仪器故障：qPCR仪本身可能存在故障或老化现象，导致检测结果不准确。
解决方案
检查温度控制：检查qPCR仪的温度控制系统是否稳定可靠，必要时进行校准或维修。
优化反应体系：优化反应体系中的各组分浓度和纯度，减少污染物的干扰。同时，注意操作规范，避免交叉污染。
更换仪器：如果qPCR仪存在严重故障或老化现象且无法修复，建议更换新的仪器以确保检测结果的准确性。
Super Lad
展源
何发
相关文章
-
QC, IQC, IPQC, QA，到底是什么鬼?
2020-05-27
-
AAS法分析茶叶中的铅,镉,砷
2020-05-27
-
红外光谱分析,你了解多少?
2021-01-11
-
三聚氰胺,你还要害多少人
2020-05-27
-
HPLC检测器,你了解吗？
2024-03-06
-
超净工作台原理,使用与维护
2020-05-27
-
选对色谱柱,快速开发方法
2020-05-27
-
安捷伦与Proscia达成合作,以加速数据驱动的精准医疗
2023-03-13
-
'die'，'device','chip'有什么区别？
2024-02-21
-
检测有机氯类农药,气相色谱法检测法
2021-01-12
加载更多