质粒构建常见问题
质粒构建常见问题及解决办法
质粒构建常见问题及解决办法
怎样选取载体？
载体一般可被划分为克隆载体与表达载体这两种类型。
克隆载体多数属于高拷贝载体，能够把外源基因跟克隆载体的质粒加以连接，导入原核细菌之中，实施大量的复制克隆。其主要用途在于保存目的基因片段。
在选取克隆载体时需要留意以下几点：
① 具备自主复制的能力，且拷贝数较高；
②带有便于筛选的选择标记；
③包含多种限制酶的单一识别序列，以供外源基因插入；
④载体应尽可能小（＜15kb），以便导入细胞和进行繁殖；
⑤运用安全。克隆载体只应存在于有限范围的宿主内，于宿主体内不进行重组，不发生转移，不产生有害性状，并且不能离开工程宿主自由扩散。
表达载体是为了让插入的外源 DNA 序列能够转录并翻译成多肽链而进行特殊设计的克隆载体。它含有特定的表达系统元件，也就是启动子--核糖体结合位点--克隆位点--转录终止信号。
按照表达的类别，表达载体能够分为以下四类：
非融合型表达载体，比如 PKK223-3；
分泌型表达载体，比如 PINⅢ-ompA1；
融合蛋白型表达载体，比如PGEX；
包涵体型表达载体，比如pBV220。
载体构建常见问题？
1. 移码或提前终止密码子问题
解决办法：仔细检查载体序列，确保没有移码突变或提前终止密码子的存在。
2. 菌株选择不当
解决办法：选择适合表达的菌株，如BL21 (DE3)，并确保菌株基因型适合表达目的。
3. 稀有密码子使用
解决办法：检查目的基因中的密码子使用情况，必要时使用常用密码子进行替换，以提高表达效率。
蛋白质表达常见问题及解决办法
1. 重组蛋白毒性问题
解决办法：选择具有严格调控系统的表达载体，如BL21-AI，或尝试不同的表达系统，如pBAD系统。
2. 蛋白质降解问题
解决办法：在裂解缓冲液中加入蛋白酶抑制剂，如PMSF，以防止蛋白质降解。
3. 蛋白质表达水平低
解决办法：优化培养条件，包括温度、IPTG用量和培养时间，以及尝试使用不同的诱导剂或表达载体。
质粒提取常见问题及解决办法
1. 质粒DNA产量低
解决办法：优化细菌培养条件，确保完全的裂解和充分的中和。
2. 质粒DNA纯度不足
解决办法：细致操作离心和清洗步骤，避免基因组DNA的污染，并增加纯化步骤。
3.质粒DNA稳定性差
解决办法：优化储存条件，避免多次冻融，并使用适宜的缓冲液，在低温下储存。
细胞铲屎官
展源
何发
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