常用的蛋白分析技术——WB实验操作步骤详解
蛋白样品的提取及蛋白含量的检测
凝胶配置
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上样
电泳
小贴士：根据实验要求可以进行适当调整，蛋白条带较大时，可延长电泳时间；条带较小时，参照预染Marker条带决定电泳时间。电泳开始的时候，开制冰机制冰，为后面的转膜做准备。
转膜（湿转）
操作步骤
1. 取出凝胶，根据Marker切下目的条带，用蒸馏水冲洗，并裁剪与SDS-PAGE凝胶相同大小的PVDF膜，滤纸应与纤维垫相同大小；
2.PVDF膜用甲醇浸泡1min后，和滤纸一同浸泡于电转缓冲液中；
3. 按照黑色板-纤维垫-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-纤维垫-白色板依次放好，夹紧板后放入湿转电转槽内，黑色板的一面对黑色负极；
4.在转膜槽中加满电转液，开始转膜。（转膜槽置于水中，并放入冰冻结块的冰袋，尽量多放几个冰袋，保证电转一直处于低温下进行。若转膜时间较长，中途温度升高，可更换冰袋）
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小贴士：蛋白大小大于140kD条件下，先在电流200mA情况下转膜120min，然后将电流提高到250mA，继续转膜30min。
封闭和抗体的孵育
漂洗
PVDF膜置于回旋振荡器上漂洗1min，重复漂洗2-3次。
封闭
用含5% 脱脂奶粉的TBST（封闭液）浸泡PVDF膜，室温摇床封闭2h。磷酸化蛋白用5%的BSA封闭2h。
一抗孵育
用含5%脱脂奶粉的TBST（检测磷酸化蛋白用含5% BSA的TBST）稀释相应的一抗，使PVDF膜浸泡于一抗孵育液中，4℃孵育过夜。
洗涤
TBST充分洗涤PVDF膜3次，15min/次。
二抗孵育
用稀释一抗体系相同的稀释液稀释HRP标记二抗，使PVDF膜浸泡于二抗孵育液中，室温孵育1h。
洗涤
TBST充分洗涤PVDF膜4次，15min/次。
显色曝光
ECL发光液A液与B液1：1混合（现配现用）；
PVDF膜从TBST洗液中取出后，用滤纸吸干水分（一般用干净镊子夹住PVDF膜，让膜的一角接触滤纸）；
将PVDF放置于成像仪上，均匀滴加ECL工作液，排出气泡，开始曝光。
小贴士：先选择自动曝光进行曝光。同一张膜上未曝光出条带的，可选择手动曝光，加长时间再次曝光。
网络
展源
何发
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