PCR反应的五大要素
PCR
引物
酶
聚合酶链式反应（PCR）是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点是实现微量DNA的指数倍增加。参加PCR反应的五种物质,分别是：引物、酶、dNTP、模板、Mg2+。
模板DNA可以来自不同的生物样本，如血液、组织、唾液等，也可以是人工合成的DNA片段。不过，
DNA的组成或复杂度会影响PCR扩增的最佳起始量。
例如，在起始量为50 µL 的PCR中，只需0.1–1 ng质粒DNA，而gDNA则需要5–50 ng。最佳模板起始量还取决于所使用的 DNA 聚合酶类型；经过改造 的DNA聚合酶对模板的亲和力更强，灵敏度更高，所需的DNA起始量更少。模板DNA的大小可以影响PCR的效率，一般来说，较小的DNA片段（如100-2000 bp）更容易被扩增。
模板DNA需要足够纯净，以避免杂质如蛋白质、RNA或化学物质的干扰，这些杂质可能会影响PCR的效率，传统的DNA提取技术通常涉及使用SDS和蛋白酶K来处理样本。SDS的主要作用是破坏细胞膜，溶解膜上的脂质和蛋白质，从而释放细胞内的核蛋白。SDS与蛋白质结合后形成复合物，有助于沉淀蛋白质。蛋白酶K则负责分解蛋白质，尤其是与DNA紧密结合的组蛋白。通过使用酚和氯仿等有机溶剂，可以进一步去除蛋白质和其他细胞成分。随后，利用乙醇或异丙醇使核酸沉淀，从而得到可用于PCR反应的纯净DNA模板。
在临床检测中，为了简化流程，常采用快速且简便的方法来溶解细胞、裂解病原体，并去除与DNA结合的蛋白质，使目标基因得以释放，直接用于PCR扩增。这种方法减少了传统提取过程中的多个步骤，提高了效率。
对于RNA模板的提取，通常采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法。异硫氰酸胍能够有效地裂解细胞并抑制RNase的活性，而蛋白酶K则用于消化RNA结合的蛋白质。在整个提取过程中，必须严格控制环境，以防止RNase对RNA的降解，确保RNA的完整性和纯度，这对于后续的RNA分析和应用至关重要。
在聚合酶链反应（PCR）中，四种脱氧核苷酸三磷酸（dNTPs），即dATP、dCTP、dGTP和dTTP，是不可或缺的反应原料。它们的比例和浓度对PCR的成功至关重要。dNTPs通常以粉末形式存在，容易因不当保存而变性，从而失去其生物学功能。dNTP溶液具有酸性，需要使用碱性物质如1M NaOH或1M Tris进行中和，调节pH值至中性范围（7.0～7.5），以保持其稳定性。建议将dNTPs小量分装后在-20℃条件下冷冻保存，以避免因反复冻融而导致的降解。
在PCR反应体系中，dNTPs的浓度一般控制在50～200 μmol/L。重要的是，四种dNTPs的浓度应保持相等，即等摩尔配制，以避免由于某一种dNTP浓度的异常导致的错配现象。如果dNTP浓度过低，可能会降低PCR产物的产量。然而，在某些特定的应用中，如通过PCR进行随机突变研究，可能会故意使用不等浓度的dNTPs，以增加非校正DNA聚合酶引入错误碱基的可能性。
dNTPs的储存液通常在pH 7.0的条件下，使用NaOH进行配制，初始浓度可达到10 mM，然后分装并储存于-20℃的环境中。在实际使用时，dNTPs的浓度范围应在20～200 μmol/L之间，且四种dNTPs必须以等浓度混合，以减少错配误差。
在PCR反应中，较低的dNTP浓度有助于减少非特异性扩增和核苷酸的错误掺入。常规PCR应用中，dNTPs的最终浓度通常设定为0.2 mM。根据目标序列的长度和组成，可以调整dNTPs的最低浓度。例如，在100 μl的反应体系中，如果四种dNTPs的浓度均为20 μmol/L，这通常足以合成2.6 μg的DNA或10 pmol/L的400碱基对序列。在某些高灵敏度的PCR应用中，如ras基因点突变的等位基因扩增，可能会使用更低的dNTP浓度（每种2 μmol/L）。
在某些情况下，使用较高的dNTP浓度可能是有益的，尤其是在高浓度Mg2+存在的条件下，因为Mg2+可以与dNTPs结合，从而减少可用于DNA合成的dNTPs数量。然而，如果dNTPs的浓度超过最佳水平，可能会抑制PCR反应。为了确保DNA聚合酶能够有效扩增，反应中的游离dNTP浓度不应超过0.010–0.015 mM，这是基于其Km值的估计。在使用非校正DNA聚合酶时，可以通过降低dNTP浓度至0.01–0.05 mM，并相应减少Mg2+的量，来提高PCR的保真度。
DNA聚合酶是PCR技术中不可或缺的催化剂，它们负责在单链DNA模板上合成互补的新DNA链。这些酶具有5'至3'方向的聚合活性，能够将核苷酸逐个添加到引物上，从而实现链的延伸。
在PCR技术的早期发展阶段，科研人员通常使用大肠杆菌来源的Klenow片段来催化链的合成。然而，这种酶对热敏感，无法在PCR过程中的高温变性步骤中保持活性，因此需要在每个循环中重新添加。
热稳定性DNA聚合酶的发现为PCR技术带来了革命性的进步。1976年，科学家从一种耐热细菌Thermus aquaticus中分离出了Taq DNA聚合酶，这种酶能够在高温下保持活性，从而允许PCR反应在无需中断的情况下连续进行。1988年，研究人员首次报道了Taq DNA聚合酶在75℃以上的高温下仍然保持活性，这使得PCR过程可以自动化，大大提高了实验的效率和便利性。Taq DNA聚合酶不仅能够扩增更长的DNA片段，而且具有更高的灵敏度和特异性，因此在1989年被《科学》杂志评为“年度分子”。
尽管Taq DNA聚合酶极大地推动了PCR技术的发展，但它也存在一些局限性。例如，Taq DNA聚合酶在90℃以上的高温下不够稳定，这在扩增富含GC或具有复杂二级结构的DNA模板时尤为明显。此外，Taq DNA聚合酶缺乏校正机制，容易在扩增过程中引入错误，这对于需要高保真度的克隆和测序实验来说是一个缺点。Taq DNA聚合酶的这种特性也限制了它在扩增长度超过5 kb片段时的应用。
为了克服这些限制，科学家们开发了性能更优越的DNA聚合酶，这些酶在保持PCR技术优势的同时，提供了更高的保真度和扩增能力。目前市场上供应的Taq DNA聚合酶主要有两种形式：一种是从Thermus aquaticus中直接提纯的天然酶，另一种是通过基因工程技术在大肠杆菌中合成的重组酶。在典型的PCR反应中，酶的用量通常为2.5单位（U），这个量适用于100微升的反应体系。如果酶的浓度过高，可能会导致非特异性扩增；而酶的浓度过低，则会减少合成产物的量。
往期有关引物的文章有好几篇，感兴趣的可以回顾下，8个引物设计秘诀，让PCR实验成功率飙升，干货-从零开始学, NCBI 引物设计的步骤是怎样的呢？求解！QPCR 干粉引物溶解稀释的最佳方案是什么？
PCR引物是合成的短DNA片段，通常包含15到30个核苷酸，它们通过与目标DNA序列的互补配对来锚定在特定的区域。在PCR过程中，DNA聚合酶利用这些引物作为起点，从3'末端开始合成新的DNA链。为了实现特异性扩增，引物必须特异地结合到目标序列的两侧，避免与基因组中的其他区域发生非特异性结合。
引物设计需要考虑多个因素以确保PCR的成功和特异性：
1序列特异性：
引物应与目标DNA序列高度互补，避免与非目标区域发生交叉反应。
2 熔解温度（Tm）：
理想的Tm范围是55–70℃，且一对引物之间的Tm差异应控制在5℃以内。
3 避免引物二聚体和自我互补：
引物序列应设计得不会导致两个引物之间或单个引物内部形成稳定的二级结构。
4 GC含量：
建议引物的GC含量在40-60%之间，以保证稳定的DNA双链形成。
5 3'末端稳定性：
引物的3'末端应避免过多的G或C碱基（不超过3个），以减少非特异性扩增，但含有1个C或G有助于提高引物的锚定能力。
镁离子（Mg2+）在DNA聚合酶的活性中扮演着至关重要的角色，它不仅作为辅助因子，还有助于dNTP（脱氧核苷酸三磷酸）的结合和聚合过程。
(1)催化活性：
Mg2+是DNA聚合酶催化活性的必要辅助因子。它能够与酶的活性位点结合，改变酶的构型，从而激活酶的催化功能。
(2) 稳定DNA结构：
Mg2+有助于稳定DNA双螺旋结构，特别是在富含GC的区域，因为GC对之间的氢键比AT对更难以在高温下断裂。镁离子的这种作用有助于在PCR的变性步骤中保持DNA的完整性。
（3）促进dNTP结合：
Mg2+能够与dNTPs中的磷酸基团形成复合物，这降低了dNTPs的负电荷，使得它们更容易接近并结合到DNA聚合酶的活性位点。
（4）影响聚合过程：
在DNA链的合成过程中，Mg2+有助于将dNTPs正确地定位到正在合成的DNA链上，确保新链的准确延伸。
（5）影响错配率：
Mg2+的浓度对DNA聚合酶的保真度有显著影响。较高的Mg2+浓度可能会增加错配率，因为它们降低了聚合酶对dNTPs的特异性识别能力。
（6）优化PCR条件：
在PCR反应中，Mg2+的浓度需要仔细优化。不同的模板DNA和引物对Mg2+的最佳浓度有不同的要求。一般来说，Mg2+的浓度范围在1-5 mM之间，但最佳浓度需要通过实验确定。
（7）影响酶的热稳定性：
Mg2+能够增强某些DNA聚合酶的热稳定性，使其在PCR的高温变性步骤中保持活性。
在PCR反应中，缓冲液的pH值对DNA聚合酶的活性和稳定性至关重要。缓冲液通常使用Tris-HCl来调节，以维持一个接近中性但略偏碱性的环境。以下是PCR缓冲液中常见的成分及其典型浓度范围的表格表示：
Tris-HCl：
作为主要的缓冲剂，Tris-HCl能够维持反应体系的pH稳定，通常浓度在50-100 mM之间。
KCl：
有助于维持反应体系中的离子强度，对酶的活性和稳定性有积极作用，浓度一般在20-50 mM。
MgCl2：
作为DNA聚合酶的辅助因子，MgCl2的浓度需要根据具体的酶和反应条件进行优化，通常在1-5 mM之间。
dNTPs：
四种脱氧核苷酸三磷酸（dATP、dCTP、dGTP和dTTP）是DNA合成的直接原料，浓度通常在50-200 μM。
稳定剂：
可能包括甘油、DMSO等，用于防止酶在冷冻过程中变性，浓度依具体成分而定。
甘油或DMSO：
作为防冻剂，有助于在低温保存时保持酶的稳定性，浓度一般在5-15%。
BSA（牛血清白蛋白）：
在某些PCR缓冲液中添加，可以减少酶吸附到管壁，从而提高酶的可用性，浓度通常在0.01-0.1 mg/mL。
PCR反应条件的优化是确保实验成功的关键因素，以下是对PCR反应条件：
目的：使双链DNA解链成单链，以便作为PCR的模板。
温度：通常设为94℃，以确保大多数DNA双链能够完全解链。
时间：20-30秒，以避免过长时间的高温影响酶的活性。
注意事项：确保达到足够的变性温度以避免DNA复性，同时避免过高的温度损害DNA聚合酶。
温度：一般介于45-68℃，根据引物的GC含量调整，通常比引物的熔解温度Tm低5℃。
时间：30-60秒，确保引物与模板有足够的时间结合，避免过长导致非特异性结合。
注意事项：过高的退火温度可能降低引物结合效率，而过低则可能导致错配。
温度：通常在70-75℃，适合大多数DNA聚合酶的活性。
时间：根据目标片段的大小和所用酶的特性调整，例如，扩增2kb片段时，Taq酶可能需要1分钟，而Pfu酶可能需要2分钟以上。
注意事项：延伸时间不足可能导致扩增不完全，过长则可能产生非特异性产物。
目的：通过多次循环实现目标DNA片段的指数级扩增。
次数：一般设定为30-40个循环，根据模板DNA的量、扩增片段的大小和产物的应用需求来调整。
注意事项：
过少的循环次数可能导致扩增量不足，而过多的循环次数可能增加错配几率，产生非特异性背景。
细胞铲屎官
展源
何发
加载更多