一文掌握细胞侵袭3D实验
将小室放入加入完全培养基的孔板中（常见的是24孔板），小室中含有密密麻麻的小孔，将细胞悬液加到小室中，细胞可通过形变穿过小室中的孔而跑到营养更丰富的小室外部并贴在外侧。通过对小室外部的细胞进行染色计数，就可以判断细胞的迁移与侵袭能力的强弱。
基本原理：
细胞迁移与侵袭实验就是将小室放入培养板中，小室内称为上室，培养板内称为下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，上室内添加上层培养液，下室内添加下层培养液。将细胞种在上室内，由于膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。
上室需铺上一层基质胶（常用人工重构基底膜材料Matrigel）以模仿体内细胞外基质（ECM），细胞欲进入下室，先要分泌基质金属蛋白酶（MMPs）将基质胶降解，方可通过聚碳酸酯膜。计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的侵袭能力。
实验步骤：
胞培养与处理—包被基底膜—水化基底膜—制备细胞悬液—接种细胞至上方小室—细胞固定—细胞染色—封片—细胞观察计数
【步骤1-2为细胞培养与前期处理】
1.观察细胞生长状态，取生长状态良好的细胞去培养基，加入无血清培养基饥饿24h。
2.将基质胶置于冰中并在4℃过夜融化，将移液管或枪头放入4℃预冷过夜。
【步骤3-8为包被与水化基质胶】
3.使用预冷的移液管或吸头混合基质胶至均匀状态。
4.在冰上，将基质胶用无血清培养基稀释至1mg/mL，使用预冷的吸头混合至均匀状态。
5.取60µL上述混合溶液垂直加入Transwell小室中，使其均匀平铺在底部，注意均匀铺胶，不要产生气泡。随后置于37℃孵育1-3小时。
6小心吸出未结合的基质胶。
7.加入100µL不含血清的培养液，将培养板置于37℃培养箱孵育30分钟，进行水化。
8.去除小室中液体，检查是否有液体穿过小室进入到下室中，若没有，则可用于接种细胞。
【步骤9-13为样本准备和细胞接种】
9.用无血清培养基配制样本，建议将工作液浓度设置成终浓度的2倍，同时设置只加培养基的空白对照组。
10.取500µl含10% FBS的完全培养基加入24孔板下室，用镊子将Transwell小室置于24孔板内。
11.消化饥饿后的细胞，用无血清的培养基重悬，根据上室细胞接种数量调整细胞密度。
按样本：细胞悬液=1:1的比例加入到小室内。12.先加入100uL的样本工作液，再加入100uL的细胞悬液，此时样本浓度被稀释2倍即为终浓度。
13.将24孔板置于37℃，5%CO2，90%湿度条件下培养24-48小时。
【步骤14-19为细胞固定、染色、拍照】
14. 取出Transwell小室，去除培养液，用PBS浸湿的棉签或棉花轻轻擦拭小室内基质胶和细胞。
15. 在24孔板干净的孔中加入600µl 4%多聚甲醛固定液，将小室放入固定30分钟。
16. 弃固定液，PBS洗涤小室内外1次。
17. 在24孔板干净的孔中加入600μL结晶紫染色液，将小室放入染色10分钟。
18. 取出小室，PBS洗涤小室内外3次。
19. 适当风干后，显微镜下观察定性研究；取3-5个视野拍照后用ImageJ计数取平均值进行定量研究。
注意事项：
1、Matrigel是一种细胞外基质，4℃时是液体，在22-35℃时快速成胶，溶解时需在4℃冰上过夜冻融，所有用品在使用前需置于冰浴，必须使用预冷的移液管、吸头及小管操作Matrigel；基质胶在室温下容易凝固，铺胶过程全程需要在冰上操作。可将冻融后的Matrigel分装在多个小管，所有分装均需用预冷的冻存管，迅速冷冻并保存，避免多次冻融。
2. 基质胶浓度也是影响细胞迁移和侵袭的因素之一，所以基质胶的浓度和稀释比例需根据供应商提供的信息和实验具体情况调整，必要时可设置预实验摸索最佳浓度和稀释比例。一般常用浓度为1mg/mL。
3. 铺胶时，尽量垂直小室底部在小室底部中间加入，可避免气泡的产生。
4. 吸出小室内未结合的基质胶时需确保移液管的尖端不会刮伤凝胶层表面。
5. 不同细胞的迁移和侵袭能力不同，可设置一系列细胞密度梯度摸索合适的细胞接种密度。
6. 小室的放置过程经常有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失，因此需特别留心。一旦出现气泡，需将小室提起或用枪头去除，去除气泡后重新放置。
7. 接种细胞1-2小时后，可对培养板进行检查，确保没有大气泡产生。但有时会观察到有极小的汽包产生，但并不影响细胞迁移和侵袭，也可轻轻敲击孔板去除。
8. 用PBS清洗小室时，需避物理触碰小室底部。可以准备几个无菌烧杯或培养皿，倒入适量PBS，依次涮洗，可提高效率。
9. 拍照前需适当晾干小室，水分会影响镜下视野。
药学科研学姐
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何发
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