色谱分析：Rs与N、K、α的关系

张明 0 2024-05-07

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分离度Rs在色谱分析中是衡量柱效至关重要的参数。分离能力不足，意味着对于复杂样品分析效果不佳；而低效率就意味着长时间。当今的分析人员，需要高分离解决难问题，渴望高效率减少加班时间。那么影响分离度的因素有哪些呢？首先，我们先了解一下分离度方程。

分离度方程式

保留因子K

保留因子K的计算公式，如下所示：

K=（tR-t0）/ t0

t0—死时间
tR—溶质保留时间

分离度Rs与保留因子K之间的关系下图所示。

当保留因子K≤5时，通过改变K值，分离度都能得到极大的改善。

当保留因子K≥10，通过改变K值，分离度得到的改善却极小。

因此，在方法开发过程中，如果色谱峰的保留因子K≤5，改变K值便能有效改善分离度；如果色谱峰的保留因子K≥10，改变其他参数将会更加有效。

图，分离案例：K=10

图，分离案例：K=20

如上图案例所示，当K=10时，二者的分离度为2.07；当K=20时，二者的分离度仅为2.16。虽然二者分离度略有增加，但此时付出的代价却是检测时间的加倍。因此，当K≥10时，利用K值改善分离度并不是一种明智的举措。

理论塔板数N

色谱柱柱效估算公式如下所示：

N≈500L/dp

L—色谱柱长度（mm）
dp—颗粒直径(um)

分离度Rs与塔板数N之间的关系下图所示。

图，分离度Rs与塔板数N之间的关系

分离度Rs与塔板数N在一定区域内近似接近线性关系，随着塔板数N的增加，分离度Rs会一直增加。所以寻找高效的色谱柱成为广大色谱工作者改善分离的常用手段。

由上述公式可知，柱效N与柱长L成正比，与粒径dp成反比。因此，只要我们在原来色谱柱基础上增加柱长、减小粒径或者同时采取这两方面的措施，均能做到增加柱效。

至于增加的比例，则由上述公式可计算。另外，上述公式简化为L/dp后则可用于以比较两根色谱柱是否等效。

例如两款色谱柱，分别为4.6*150mm,3um和4.6*250mm,5um，由公式L/dp可推知，两者L/dp=50，因此两款色谱柱可视为等效。

根据分离度方程式所揭示的数学关系，我们可利用此公式预判改变柱效N后获得的分离度Rs。例如，某物质在4.6*250mm,5um的色谱柱上的分离度为1.0，尝试更换为同款4.6*250mm,3um的色谱柱（微信公众号：有机合成大菜籽）。由公式推算可知，更换后其达到的分离度约为1.3。因此，利用此公式通过对分离度的预判，可避免不必要的试验。

选择性α

选择性α的计算公式如下所示：

α=k2/k1

k1—色谱峰1的保留因子
k2—相邻色谱峰2的保留因子

分离度Rs与选择性α之间的关系如图5所示。

图，分离度Rs与选择性α之间的关系

当选择性1≤α≤2时，通过改变α值，分离度都能得到极大的改善。

当选择性α≥6时，通过改变α值，分离度Rs得到的改善相对变小。

影响分离的三要素中，选择性α对分离的影响是最大的。即使选择性α的微小改变，也能带来分离度Rs的巨大改变。所以，选择性α是改善分离度Rs的最有效方法。

实际工作中，选择性α一般选用1≤α≤2。

为什么呢？

当溶质的K介于1≤K≤10，假设某物质分离条件为4.6*250mm,5um的色谱柱，流速为1.0ml/min，此时t0≈2.5min。当某物质保留因子K1=1，若α=2，则相邻物质K2=2，此时两物质的保留时间分别为t1≈5.0min, t2≈7.5min，这种情况下，二者已经完全分离（微信公众号：有机合成大菜籽）。因此选择性α＞2时，分离度Rs已经满足要求，不必再改善分离。

分离条件对三要素的影响

以上部分，我们对分离度Rs与塔板数N，保留因子K，选择性α之间的关系进行了论述。那么方法开发过程中，如何改善这三要素呢？通过图6我们可以找到具体的控制措施。