这些蛋白质互作实验方法，你都了解吗？？

展源 0 2024-02-23

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蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)对解析生命活动过程与疾病发生发展过程至关重要。随着时代发展，虽然大规模、高通量的生物学研究手段大大促进了蛋白质相互作用的预测，但这种预测还需要进一步利用体外和体内系统进行验证。分析蛋白质互作的方法多种多样，跟小析姐一起来看看吧。

免疫共沉淀 Co-IP

免疫沉淀 (IP) 、免疫共沉淀 (Co-IP) 和pull-down 都是常用的从复杂的混合样品中获取目标分子，以进行下一步分析的方法，如检测蛋白质能否相互作用。在此类实验中，被研究的蛋白质称为“诱饵”蛋白，“诱饵”蛋白的互作蛋白称为“猎物”蛋白。“诱饵”蛋白与“猎物”蛋白结合后，利用靶蛋白—抗体—Protein A/G—磁珠/琼脂糖珠的结合方式获取复合物，再通过SDS-PAGE、Western blot 或质谱等方法进一步对复合物中的靶蛋白进行分析。

免疫共沉淀方法简单，是识别感兴趣蛋白质的相互作用、深入了解其结构和功能的初步实验方法。但是它也有相应的局限性，比如很难验证两种蛋白质是否直接发生相互作用、不能得到这种相互作用亲和力等定量信息等。因此需要在相互作用分析与筛选后，使用其他方法验证更详细的相互作用信息。

图1：使用抗体进行 Co-IP 与使用 Strep-Tactin®XT 进行pull-down

融合蛋白沉降 pull-down

IP和Co-IP通过固定抗体来捕获诱饵蛋白质及其结合分子，而pull-down可使用带亲和标签的目的蛋白进行，在体外验证蛋白间的直接相互作用。 Pull-down是通过磁珠/琼脂糖填料固定带有标记的“诱饵”蛋白，从细胞裂解液、纯化蛋白或表达系统中捕获“猎物”蛋白，然后将复合物蛋白分离后进行凝胶或质谱分析，从而确认互作蛋白的 “身份”。Pull-down较Co-IP的优点在于，不仅能证实靶蛋白的直接相互作用，且洗脱条件也很温和，保留蛋白质结构与天然蛋白复合体的同时，又避免将非特异性结合的蛋白质共同洗脱下来，确保了后续分析的准确性。这一优点在Strep-tag技术中充分体现。图2为应用MagStrep“type3”XT 磁珠进行蛋白质Strep pull-down步骤图。

图2：Strep pull-down互作蛋白质分析示意图。

A: Strep-Tactin®XT包被磁珠；B: 固定带有Twin-Strep-tag®标记的“诱饵”蛋白；C: 孵育“诱饵”蛋白与含有“猎物”蛋白的溶液；D: “猎物”蛋白与“诱饵”蛋白形成复合物；E: 复合物蛋白进行凝胶分析；F: 复合物蛋白进行质谱分析

表面等离子共振SPR

表面等离子体共振(surface plasmon resonance, SPR)技术是一种基于物理光学现象的检测技术，是分析生物分子间结合作用的常用方法之一，通过直接、实时、无标记的测量来分析分子间的亲和力及动力学参数，在生物治疗药物的发现和开发中发挥着重要作用。

SPR的原理是在芯片表面固定一层生物分子识别膜，然后将待测样品流过芯片表面，若样品中有能够与芯片表面的生物分子识别膜相互作用的分子，会引起金膜表面折射率变化，最终导致SPR角变化，通过监测SPR的角度变化，获得被分析物的浓度、亲和力、动力学常数和特异性等。

图3：SPR检测原理与Strep-Tactin ® XT包被的感受器晶片

图三中所示的基于Strep-tag®系统方法，采用是间接的捕获方式来分析目的蛋白，解决配体稳定性差、纯度低、再生困难的同时，可进行定向、高亲和力的配体固定，实现长解离时间和慢解离速率的测量，最小化非特异性结合。

生物膜干涉 BLI

生物膜干涉技术（Bio-Layer Interferometry, BLI）, 是一种无标记（Label-free）光学生物传感技术，用于实时监测分析生物分子相互作用（例如抗原-抗体相互作用），并对其结合强度和动力学进行量化分析。与SPR技术不同的是， BLI技术中不使用金属芯片，而是利用生物传感器。将配体偶联在传感器的末端，浸入样品中来捕获分析物。

图4：BLI传感器与 Strep-Ta ctin®XT 相结合，特异性捕获 Twin-Strep-tag® 融合蛋白

当光束射出后，对来自生物传感器末端表面的反射光进行测量，如果配体与分析物相互作用，则末端表面的膜层比仅有配体（未结合分析物）的膜层更厚，反射光波长也不同，两种反射光谱之间的波长形成一束干涉光谱。BLI 仪器通过测量来自配体，或配体-分析物的复合物的干涉光谱位移值，实现结合强度和动力学的实时监测。

邻近蛋白标记BioID

邻近蛋白标记(biotin identification，BioID，生物素标记) 方法可以鉴定诱饵蛋白附近的蛋白质。通过将生物素连接酶(BirA)与诱饵蛋白融合表达，加入适量生物素，融合蛋白的相互作用/附近环境中的蛋白质会被生物素化。之后通过链霉亲和素或Strep-Tactin®进行亲和纯化，将被生物素化的蛋白质从细胞裂解液中富集出来，产物做质谱鉴定。

图5：BioID的原理