【干货】紫外分光光度计使用的难点解析

赵桂芝 0 2024-01-15

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准确测定有机化合物的分子结构，对从分子水平去认识物质世界，推动近代有机化学的发展是十分重要的。采用现代仪器分析方法，可以快速、准确地测定有机化合物的分子结构。在有机化学中应用最广泛的测定分子结构的方法是四大光谱法：紫外光谱、红外光谱、核磁共振和质谱。紫外和可见光谱（ultraviolet and visible spectrum）简写为UV。今天就跟小析姐一起来看看紫外的知识吧。

紫外光谱的发展史

1852年，比尔(Beer)参考了布给尔(Bouguer)1729年和朗伯(Lambert)在1760年所发表的文章，提出了分光光度的基本定律，即液层厚度相等时，颜色的强度与呈色溶液的浓度成比例，从而奠定了分光光度法的理论基础，这就是著名的朗伯比尔定律。1854年，杜包斯克(Duboscq)和奈斯勒(Nessler)等人将此理论应用于定量分析化学领域，并且设计了第一台比色计。到1918年，美国国家标准局制成了第一台紫外可见分光光度计。此后，紫外可见分光光度计经不断改进，又出现自动记录、自动打印、数字显示、微机控制等各种类型的仪器，使光度法的灵敏度和准确度也不断提高，其应用范围也不断扩大。紫外可见分光光度法从问世以来，在应用方面有了很大的发展，尤其是在相关学科发展的基础上，促使分光光度计仪器的不断创新，功能更加齐全，使得光度法的应用更拓宽了范围。

紫外分光光度计工作原理

1、物质的吸收光谱本质上就是物质中的分子和原子吸收了入射光中的某些特定波长的光能量，相应地发生了分子振动能级跃迁和电子能级跃迁的结果。由于各种物质具有各自不同的分子、原子和不同的分子空间结构，其吸收光能量的情况也就不会相同。因此，每种物质就有其特有的、固定的吸收光谱曲线，可根据吸收光谱上的某些特征波长处的吸光度的高低判别或测定该物质的含量，这就是分光光度定性和定量分析的基础。

2、又因为许多物质在紫外-可见光区有特征吸收峰，所以可用紫外分光光度法对这些物质分别进行测定（定量分析和定性分析）。紫外分光光度法使用基于朗伯-比耳定律。

3、朗伯-比耳定律(Lambert－Beer)是光吸收的基本定律，俗称光吸收定律，是分光光度法定量分析的依据和基础。当入射光波长一定时，溶液的吸光度A是吸光物质的浓度C及吸收介质厚度l(吸收光程)的函数。

4、首先确定实验条件，并在此条件下测得标准物质的吸收峰以及其对应波长值（同时可获得该物质的最大吸收波长）；再在选定的波长范围内（或最大波长值处），分别以（不同浓度）标准溶液的吸光度和溶液浓度为横、纵坐标绘出化合物溶液的标准曲线得到其所对应的数学方程；接着在相同实验条件下配制待测溶液，测得待测溶液的吸光度，最后用已获得的标准曲线方程求出待测溶液中所需测定的化合物的含量。

5、具有芳香环或共轭双键结构的有机化合物，根据在特定吸收波长处所测得的吸收度，可用于药品的鉴别、纯度检查及含量测定。

紫外分光光度计难点——校正方法

紫外分光光度计的校正方法：分光光度法的最重要的一个物理化学量是吸光度。为了获得准确的研究结果，准确测得样品溶液的吸光度是非常重要的。一般，分析结果的不可靠性与偶然误差和系统误差有关。偶然误差影响测量的精密度，可通过足够数量测量的统计处理来减少;系统误差影响测量结果的准确度，可在大体相同实验条件下，用比较一种物质的准确测量结果，使系统误差统一起来。而分光光度计的系统误差(波长校正、分光光度计的慢散光、放大器的线性响应、暗电流和比色皿的光程)和操作误差(温度改变、仪器读数、操作者的改变、使用物质的纯度、称量和浓度、pH)对测量吸光度的影响是可以检查和校正的。关于操作误差，多数情况下，通过严格按操作程序测量、仪器调零、准确称量等来控制或减少这种误差的产生。关于仪器的系统误差，可通过对分光光度计的定期校正来克服，若所需准确度很高的测量，则必须天天校正。

紫外分光光度计难点——读数不稳定

1、先不放比色皿，看仪器是否漂移。如果不漂移，说明仪器正常。

2、放入空白溶液比色皿调零，读数漂移到一定数值后，取出比色皿看一下，内壁是否有极细小的气泡。

一般紫外分光光度计读数不稳定的根本原因应该有两类：一类是能量降低，信噪比下降，这个可能性比较大；另一类是信号接收和处理故障。

1、能量降低

（1）比色皿

如果是在400nm以下波长测量，需使用石英比色皿，假如使用普通玻璃比色皿会吸收大部分的紫外能量。还有比色皿一般有光面和毛面之分，毛面是手捏的，光面是对正光路的。

（2）样品架：

检查样品架是否在正确的槽位上，光是否全部照在比色皿上。方法是把波长设定到550nm左右，这时是比较明亮的黄绿色光，在样品室内用个小纸片挡下就能看到光斑。这个方法也能检测可见区的光源是否正常，滤光盘及波长驱动是否正常。

（3）空白样品

样品室不放任何东西对空气调零，看是否稳定。如果稳定的话，应该是空白样品本身吸光度太高了。方法是先对空气调零，然后把空白样品放入光路中看读数。如果读数很大，例如接近3A，则不可用。

（4）光源

先确认分析波长值，一般紫外可见有2个光源，紫外区用氘灯，可见区用钨灯，切换点一般在340nm-400nm。钨灯光较为明亮刺眼，氘灯光偏青紫色。如果仪器后面有透光窗口可以直接看，如果没有的话，需要打开外壳，打开灯室罩。光源都是用寿命的，能量变弱或干脆不亮了，要换灯。也有比较小的可能是光源供电电路故障，例如电源老化后可能导致无法正常点亮氘灯。

（5）光路

看光路是否偏了，可以把波长设定到550nm左右，观察样品室内有无黄绿色光线，光斑能否正确照在接收器窗口上。确认灯室内光源光斑是否正确照在单色器入狭缝上，确认光路中有无杂物挡住。确认单色器内反射镜、透镜、光栅、滤光片等是否发霉或积满灰尘，这个需要厂家才能处理。

（6）驱动电路故障

例如滤光盘驱动异常，导致滤光片用错或者干脆光路被遮挡。一般厂家或专业人员处理。

2、信号接收和处理故障

接收器（例如光电池或者光电倍增管）、放大电路、AD转换电路等都有可能。这类问题一般由厂家或专业人员处理。

责任编辑：展源

审　　核：何发