沉淀是溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程。蛋白质从溶液中析出的现象，称为蛋白质的沉淀。

优势：蛋白沉淀的最主要的优势就是操作简便、成本低、易于实施。

劣势：此方法仅去除了蛋白质，内源性杂质并没有去除掉，长时间检测可能会对色谱柱和仪器的寿命产生影响。所以，要对色谱柱和仪器做定期维护。

处理后的样本浓度会被稀释，不适用于浓度低的目标物和质谱响应偏低的情况。

PPT虽然有着看似简单的流程，真正操作起来还是有一些令人“尴尬”的步骤，如：1）96孔板通常不能承受较大离心力而影响离心效果，微量离心管又不能满足通量操作的需求；2）需要多次的液体转移操作，步骤烦琐并容易引入人为误差；3）混匀和离心过程有时要加盖开盖，存在交叉污染风险；4）相关设备较多，设备投入和人工投入大，难以自动化或半自动化等等。正因为以上这些原因，操作更简单的ISOLUTE PPT+蛋白沉淀板被越来越多地接受和应用到蛋白沉淀，因为它简单高效，只需按下图操作即可，免除了涡混、摇匀、加盖开盖、离心取上清等操作，步骤更少、流程更简单、耗时更短，帮助个人效率和产出成倍提高。

1.有机溶剂沉淀法

此方法为临床质谱领域最常用方法，一般沉淀试剂以甲醇、乙醇、乙腈为主。个别项目会在有机溶剂中加入一定量的有机酸来提高沉淀效率。例如同型半胱氨酸的检测，一般会在有机溶剂中加入一定量的三氟乙酸或者三氯乙酸。在做血浆或血清样品时，多用甲醇或乙腈沉淀蛋白，一般情况样本与沉淀剂的比例为乙腈最低1:2（一般1:3以上），甲醇最低1:3（一般1:5以上），有实验显示以血清：水：乙腈比例为1:2:4.5时去除效果最好。

适用目标物：生物小分子、糖类。

原理：有机溶剂的沉淀原理是降低水的介电常数，导致具有表面水层的生物大分子脱水，相互聚集，最后析出。

优点：

a)分辨能力比盐析法高，即蛋白质只在一个比较窄的有机浓度下沉淀；

b)沉淀后不用需考虑除盐，过滤较为容易。

2.盐析法

当目标物为非蛋白质时，纯盐析法在临床质谱领域应用较少，因为沉淀后会引入高浓度盐，长时间进样的话会对仪器灵敏度和柱压产生影响。所以，一般使用盐析法沉淀后，样本还需经过稀释、减少进样量或者透析除盐等步骤。盐析法可与其他沉淀方法结合使用。

适用目标物：盐析法沉淀出的蛋白并没有失活，所以主要用于蛋白质和酶的提取。

3.加热凝固法

原理：将接近于等电点附近的蛋白质溶液加热,可使蛋白质发生凝固( coagulation)而沉淀。加热首先是加热使蛋白质变性,有规则的肽链结构被打开呈松散状不规则的结构,分子的不对称性增加,疏水基团暴露,进而凝聚成凝胶状的蛋白块如煮熟的鸡蛋,蛋黄和蛋清都凝固。此方法主要选择性去除不耐热的杂蛋白。

适用目标物：目标物需要有较强的热稳定性，例如葡萄糖。

其余的蛋白沉淀法还有等电点沉淀法、非离子多聚物沉淀法、生成盐复合物沉淀法等，这些方法临床质谱领域应用较少目前常见的临床质谱项目中应用蛋白沉淀作为前处理的有药物检测（极大多数）、同型半胱氨酸、甲状腺激素、葡萄糖、水溶性维生素等。

理论上，化学活性越高的基团越容易进行衍生化处理。常见的可修饰基团包括：醇羟基、酚羟基、酮基、醛基、氨基、羧基、巯基、烯基等。在方法学建立过程中，引入化学衍生技术将带来以下优点。

（1）提升目标分析物稳定性：当目标物在前处理和分析过程中易分解时，我们设计衍生化反应，对其活性中心进行稳定化修饰，从而保障检测过程的精密度和准确度。

（2）提升目标分析物的质谱响应：当目标物缺乏可带电的结构单元或在质谱中难以形成特征碎片离子时，我们通过衍生化反应引入易带电或有良好碎裂行为的基团，从而改善待测物的检测灵敏度。

（3）改善目标分析物的色谱行为：当目标物在常规分离模式（疏水、亲水）下保留较弱时，可以通过化学衍生引入特定基团提高保留强度；当分离手性化合物时，可通过对手性中心上官能团的修饰，放大手性异构体空间结构上的差别，从而获取更好的色谱分离效果。

（4）合成稳定同位素内标：当目标分析物的稳定同位素内标尚未实现商品化时，可通过使用含有稳定同位素的衍生化试剂合成衍生化产物，间接利用其作为稳定同位素内标，从而保障稳定同位素稀释法的顺利实施。

随着质谱平台在我国医疗机构的进一步普及，化学衍生技术的发展成为必然趋势。如前所述，对于特定的项目，该技术能显著提升定量水平。但同时不可忽视的是，衍生化反应的引入亦将对方法学的建立造成一些不利影响，主要包括：

（1）衍生化产物的降解问题；

（2）过量的反应物和生成的副产物会带来潜在的基质效应；

（3）苛刻的反应条件和冗长的孵育时间会影响方法学通量；

（4）额外化学试剂和有机溶剂的使用会加重实验室污染；

（5）处理步骤的增加容易降低定量精密度和准确度，从而提升质量控制的难度。

针对上述问题，从业人员需要在方法学建立和实施过程中做更多的工作，例如，

（1）除了考查目标化合物在衍生化前的稳定性外，其衍生化产物在储存与分析过程中的稳定性亦需系统考查；

（2）需要适当的使用固相萃取、液液萃取等方法纯化衍生化产物，或引入快速、简单、便宜、高效、可靠、安全（QuEChERS）等技术去除体系中的杂质，从而最大程度上降低基质效应对定量的影响；

（3）设计温和、高效的衍生化路径，在保障反应产率的前提下，尽可能提升化学衍生的通量；

（4）避免采用高毒性的衍生化试剂，从而降低实验室污染，保障衍生化方法的可应用性；

（5）与常规直接检测方法相比，虽然化学衍生的加入并不会带来质控规则的改变，但失控后的原因分析和结果处理过程无疑将更加复杂，从业人员需要额外关注化学衍生过程涉及的各个要素（包括衍生化试剂是否变质、反应环境和条件是否改变等）方能准确解决相关质控问题。总体而言，只有在合理设计衍生化方案、系统优化反应条件、全面评估反应效率，适当引入纯化方案、持续关注质量控制的前提下，化学衍生技术才能真正发挥其优势，达到提升LC-MS/MS方法检测效果的目的。

这是一种相对简单快捷的湿化学技术，它基于分析物在两种互不相溶的溶剂（如甲醇和正己烷）之间的溶解度，即目标分析物从其原产溶剂进入一种“极性兼容”的溶剂，在其中它（更）容易溶解。对于尿液等水性生物基质中含有的高非极性分析物，分析物将会被分离到添加的不相溶的非极性溶剂中。

1.溶剂的互溶性

液液萃取是目标化合物在互不相溶两相溶剂间转移，因此在液液萃取是在两种或两种以上互不相溶的溶剂中进行的。在液液萃取方法中，首先要关注溶剂的互溶性。常见溶剂件的互溶性见图4-1。通常有机溶剂间的互溶性要高于有机溶剂与水的互溶性。但也有一些有机溶剂可以与水互溶，例如：丙酮、乙腈、甲醇、乙醇、二甲基甲酰胺、二甲亚砜、1，4-二氧六环、N-甲基吡咯烷酮、异丙醇、四氢呋喃、三氟乙酸等。需要强调是，在无机盐盐析的作用下，互溶的有机溶剂和水间仍可以发生分层的现象。

2.溶剂的密度

溶剂的密度是液液萃取时应该关注的一个参数。大部分有机溶剂属于无色，与水的颜色接近。在萃取分层时，无法通过颜色来确定有机溶剂层还是水层。有机溶剂的密度比水大，则在萃取分层时，处于水相的下层；相反，有机溶剂的密度比水小，则浮在水相上层。

3.溶剂间溶解度

溶剂间溶解度是指一种溶剂在另一种溶剂中最大溶解的能力。但高于一定指标后，则表示两种溶剂可以互溶；低于一定指标后，则表示两种溶剂不溶。当两种互不相溶的溶剂混合后会形成分层，但各自溶剂都会溶解少量的对方溶剂。常见溶剂在水中的溶解度以及水在常见溶剂中溶解度见表。例如：二氯甲烷是液液萃取方法中常使用的萃取溶剂，与水不互溶。但在使用二氯甲烷萃取水中化合物时，静止分层后，水相中含有1.6%的二氯甲烷；而有机相中含有0.24%水分。

4.溶剂的选择

在液液萃取中，溶剂的选择是首要的任务。溶剂选择的好坏直接影响萃取的结果。溶剂选择的总体原则是对目标化合物溶解度大，对样品基质和杂质溶解度小，且化学性质稳定，毒性小以及样品溶液不互溶。根据相似相溶理论，萃取溶剂与目标化合物极性等化学性质越相近，提取效率越高。但实际中，很难找到与目标化合物性质如此合适的一种萃取溶剂，此时可以选择两种或多种溶剂组合成混合萃取溶剂。

萃取溶剂选择的原则有：

（1）在水相中溶解度低。

（2）具有低沸点和较高的挥发性，便于目标化合物的浓缩富集。

（3）溶剂纯度高，避免引入杂质干扰目标化合物的检测。

（4）与液相色谱分析有良好的兼容。如在液相色谱紫外检测时，要避免使用丙酮等具有较强紫外吸收的有机溶剂。

（5）要与目标化合物的极性相匹配，以便提高萃取效果。