HPLC峰形问题原因剖析及解决办法

展源 0 2023-06-21

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HPLC峰形问题

峰形异常（包括峰拖尾，前延和裂分等）是高效液相色谱中最常见的问题之一，因此在绝大多数系统适用性实验中都包括峰形的测定，量化的峰形也可以随时被追踪到。

不好的峰形会减少邻近洗脱出来的峰的分离度（如图1），降低测定的峰面积的精确度和准确度；同时，峰形的变化也是色谱柱开始失效的信号之一。对于色谱分析人员来说，快速找到异常背后的原因并针对性地解决也是一项重要的专业能力。

图1 峰型异常

出现相同类型的拖尾峰

色谱图中所有峰拖尾或峰变形通常是由物理作用导致的，而非化学作用。

如果色谱图中的峰形均表现相同类型的变形（图2），主要问题发生在分析物在色谱柱中迁移之前。

图2. 由于色谱柱筛板部分堵塞或色谱柱塌陷，色谱图中所有峰形均出现了变形

1、原因剖析：

玻璃料或柱头的空隙部分堵塞，此类峰变形最常见的原因是筛板部分堵塞或色谱柱头塌陷。

除非在推荐的pH范围之外使用色谱柱，否则现在的柱子基本不会受到空隙的影响。

但是，筛板堵塞仍然是一个普遍存在的问题。对于5μm的色谱柱，入口端的筛板通常具有2.0μm的孔隙度；对于3μm的色谱柱，具有0.5μm的孔隙度。

如果颗粒物来自于样品，或磨损的泵密封圈或者流动相颗粒物进入色谱，它们通常会聚集在筛板上。

这些颗粒会影响样品在色谱柱入口端的分流，使得部分样品通过不同的流动路径到达色谱柱，因此会晚于另一部分样品。
由于此时或此位置未发生分离，因此所有分析物会以相同的方式被扰乱，进而色谱图显示所有峰均具有相似的峰拖尾或变形。

2、解决办法：

为了防止这一问题的发生，如果流动相可能含有颗粒（如缓冲沉淀物或灰尘），应对其进行过滤，并在泵密封严重磨损之前更换新的密封圈。

如果样品含有颗粒碎片，应用0.5μm微孔滤膜对样品进行过滤或对样品进行5min左右的短暂离心，以去除颗粒。

强烈建议在自动进样器下游安装0.5μm孔隙度的串联过滤器，以过滤任何意外进入HPLC系统的颗粒物。如果串联过滤器滤片发生堵塞，系统背压会升高；而更换滤片十分简单、快速和经济。采用串联过滤器可显著延长色谱柱的使用寿命，而且经济实惠。

裂峰或双峰

如果峰形解析不正确或是未完全分离的重叠峰，可能会被误认为色谱柱或缓冲液的问题。

如果仅部分解析两个峰形，则可能会认为其是裂峰或双峰。如图3显示的情形。

图3. 由于存在第二个组分而产生分裂峰。（a）25ng / mL，和（b）等离子体中10ng/ mL的药物（第二个峰）（10 ng/mL血浆中的药物（第二个峰））

在图3(a)中，可观察到与图2极为类似的峰变形，其表明筛板堵塞。

更换色谱柱不能解决此问题，所以筛板堵塞并非导致这一现象的原因。如果减少色谱柱上样品，如图3(b)，峰形看起来更像是两个峰，而不是一个肩形峰。

由此进行了进一步的研究，证实了存在第二个峰。调整方法的条件后，两个峰完全分离。

伸舌峰

由于目前的色谱柱性能优良，伸舌峰的现象已相当少见。

伸舌峰一般是色谱柱内发生沟流或色谱柱结构的坍塌导致的。

如果在制造商推荐的条件下使用色谱柱，这种情况则很少发生。

大多数硅胶柱在pH2-8的范围内可以保持稳定。

pH低于2时，键合相会发生水解；pH高于8时，硅胶会溶解。

如果您需要在此pH范围以外使用操作HPLC系统，请确保选择在选定条件下会保持稳定的色谱柱。

图4显示了因柱过载（色谱柱发生沟流）导致的伸舌峰。

图4. 过载导致的伸舌峰。（a）正常的峰形；（b）伸舌峰。

图4a中显示了正常的峰形；在约500次进样后，观察到伸舌峰（图4b）。

这种改变是该方法所特有，经常在前一次分析结束后，下一次分析开始时突然发生。

出现伸舌峰后，唯一有效的解决办法就是更换色谱柱。

该柱内径为100x2.1mm，柱内填充5μm 粒径的C18填料。流动相A是10mM碳酸氢铵（pH9.0）；B是甲醇（MeOH）。

该方法包括5％B等度洗脱段，然后用80%B淋洗。

这种特殊的色谱柱可专门用于高达100％的水流动相，且无封端。

当流动相pH值升高时，封端可保护硅胶免于溶解。

在这种情况下，所使用的色谱柱流动相pH应远高于推荐的范围，并且无需保护性封端。硅胶在pH为9时会逐渐溶解，直到柱床结构不再稳定，并且柱床会发生移动，产生塌陷或通道，而这又会导致图4b伸舌峰的形成。

可以使用较低的流动相pH或采用在较高pH下能够保持稳定状态的色谱柱，以避免这一问题。

质谱学堂

内容来源：质谱学堂

责任编辑：展源

审　　核：何发

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