作者：Ralph Weber博士，Bruker BioSpin高级EPR应用科学家;Sandra Eaton博士和Gareth Eaton博士，丹佛大学(DU)化学和生物化学系教授。

电子顺磁共振(EPR)，或称电子自旋共振(ESR)，早期开发出来用作一种测量电子自旋弛豫时间的方法，现今已发展成一种广泛应用的工具。EPR被广泛应用于生物科学和制药行业，包括监测产品稳定性、杂质分布、降解、风味稳定性和保质期，以便实现质控和过程控制等。生物医学方面的EPR应用包括自由基检测，如活性氧物种(ROS)和活性氮物种(RNS)，以观察并评估氧化应激和细胞损伤。从化学结构到分子间相互作用，我们都可以利用连续波(CW)和脉冲EPR技术获得洞见。

EPR的演变

Yevgeny Zavoisky 于 1944 年在俄罗斯的喀山首次发现 了EPR现象。尽管此前很可能已经有人观察到过 EPR 信号，但其结果却被认为不可重现。Zavoisky 的观察结果促成了第一EPR 波谱仪的开发，最初使用的是 MHz 频段。

早期的大多数EPR实验均使用CW方法进行，但脉冲和快速扫描(RS)-EPR技术的发展使该EPR的应用领域日益多样化。虽然脉冲EPR的分析能力能够洞察CW-EPR提供不了的信息，但由于对精密设备和专业知识的要求高，所以脉冲EPR在科学界的广泛使用历史上一直受限。许多自旋系统能够在室温下记录CW-EPR波谱，再加上其高灵敏度，因此大多数EPR应用仍采用CW方法。脉冲EPR的优点之一是用户能够挑选弛豫时间或长或短的物种，便于对混合物进行差分测量。

不断变化的EPR形势

自从自旋回波在核磁共振(NMR)中被发现后，人们几乎花了十年时间才在EPR中实现其全部潜力。电子自旋回波包络调制技术(ESEEM)的发展是其中一项重大突破，它被证明是电子-核双共振(ENDOR，一种结合了EPR和NMR的技术)的一种非常强大的附加手段，不仅可以测量较大的超精细耦合，还可以测量与未成对电子环境中的核自旋之间的小得多的偶极相互作用1。该研究阐明了探测顺磁中心周围核环境的超精细相互作用。它标志着早期EPR发展的一个阶跃变化，后来扩展到用于研究溶液中的自由基。2

电子-电子相互作用可能与电子-核相互作用具有相同的强度量级，这一发现催生了脉冲电子-电子双共振(PELDOR)方法，也称为双电子-电子共振(DEER)，它被用于测量聚合物、蛋白质和DNA中未成对电子之间的距离3。该技术目前被广泛用于生物学和生物化学中的结构分析。

开发快速扫描EPR

丹佛大学化学和生物化学系进行的研究突出了EPR的最新创新之一。快速扫描(RS-EPR)技术的发展，作为除CW和脉冲EPR以外研究未成对电子的第三种方法，为大多数样品提供了更高的灵敏度，并为研究更快的反应动力学打开了大门。

在RS-EPR中，磁场在相对于电子自旋弛豫时间较短的时间内扫过共振点。快速扫描信号的反卷积提供了吸收波谱，相当于常规一阶微分形式的CW波谱的一次积分。快速扫描波谱的正交检测允许同时测量自旋系统响应的吸收和弥散分量。在线性或正弦扫描中，在往高场或低场方向的扫场过程中均可采集谱图。将所有这些与相干平均中固有的噪声过滤相结合，可以显著提高信噪比。RS-EPR使得研究人员能够在每次扫描中检测全波谱，并能在不饱和的情况下使用更高的微波功率。这些优点在进行低频EPR成像时尤为明显。尽管仍处于早期阶段，但强有力证据表明，RS-EPR有望取代过去70年来作为标准的CW-EPR。4

RS-EPR的重点之一是开发临床前成像仪，以满足生物医学研究人员和肿瘤学家进行肿瘤生理学测量的需要，包括O2浓度、pH值和氧化还原状态。RS-EPR对临床前成像有效，因为它与CW-EPR相比具有更出色的灵敏度、更高的空间分辨率、更短的采集时间，并可在单位时间内进行更多的临床前成像测量。由于动物会排出EPR显像剂，因此这些优势对于体内研究、图像采集尤其重要。

对于某些顺磁性物种，尤其是过渡金属和镧系元素，弛豫时间很短，很难在室温下进行检测，这意味着研究人员必须降低温度才能进行研究。同样，为了测量自由基之间的相互作用，需要低温以使横向弛豫时间足够长，从而获得所需的信息。因此，低温技术的发展是EPR发展的重要组成部分。实现低温所需的液氦(He)成本颇高，阻碍了EPR方法的使用。此前，一罐液氦平均仅可维持一个实验室一周的使用，限制了可以进行的实验数量。而采用闭式循环无制冷剂的氦冷却系统，仅用一瓶压缩氦气，即可在5开尔文下进行一年的EPR实验。这对于大学的研究来说优势巨大，借此学生们无需每次消耗液氦即可对大量样品进行实验。

EPR的未来

自20世纪40年代被发现以来，EPR已成为价值日显的自由基检测方法。台式EPR系统使该技术更加易于获取，大大增强了易用性，降低了拥有成本，并能以极小的占地面积提供先进功能。在资金允许的范围内，EPR正在多个方向上持续发展，包括适配更高和更低的微波频率和磁场、更高和更低的温度，以及适用于更大和更小的样品。

随着科学家对EPR的探索日益加深，该方法在许多领域显现了不断增长的潜力。例如，EPR可用于肿瘤生理学成像、检测材料中的自由基、深入探索膜蛋白的结构和功能，以及酶的反应机制。EPR作为检测工具的重要性还在不断演进。RS-EPR等最新创新将在提高灵敏度方面迈出新的一步，带来更非凡的成像能力。

参考文献：

1. Feher G (1959) Electron Spin Resonance Experiments on Donors in Silicon. I. Electronic Structure of Donors by the Electron Nuclear Double Resonance Technique Phys. Rev. 114, 1219. DOI:https://doi.org/10.1103/PhysRev.114.1219.

2. Hyde JS and Maki AH (1964) ENDOR of a free radical in solution. J Chem Phys; 40:3117––3118. doi: 10.1063/1.1724957.

3. Glaenzer J, Peter MF and Hagelueken G (2018) Studying structure and function of membrane proteins with PELDOR/DEER spectroscopy - The crystallographers' perspective, Methods; 147: 163-175.

4. Eaton SS, Shi Y, Woodcock L, Buchanan LA, McPeak J, Quine RW, Rinard GA, Epel B, Halpern HJ and Eaton GR (2017) Rapid-scan EPR imaging, Journal of Magnetic Resonance, 280: 140-148.