T 细胞活化实验干货，一文帮你梳理清楚

赵桂芝 0 2022-08-04

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T 细胞的活化是研发 T 细胞相关疗法的基石。目前有多种已建立的体外刺激活化 T 细胞的方法，但实际过程中会发现同样的原理方法，其具体步骤中常常隐藏了很多的「套路」。在看过下面系统性的方法介绍，我终于摆脱了「套路」，不再被 T 细胞活化为难，一起看看吧。

T 细胞的活化与增殖研究表明，诱导 T 细胞的活化与增殖需要两种信号：一种是 TCR / CD3 与抗原提呈细胞（APCs）表面特异的 MHCⅡ 抗原肽复合物结合产生的特异性抗原刺激信号；另一种是非特异性协同刺激信号，由 APCs 表面的协同刺激分子和 T 细胞的相应受体相互作用后产生，其中 CD28 / B7 是最为重要的协同刺激分子，能增加 IL-2 的产生，加速 T 细胞增殖，阻止细胞进入无反应状态或死亡。

目前激活扩增 T 细胞的常见方法有：直接使用功能学抗体、磁珠法以及多聚体法（CD3 / CD28 抗体偶联 Streptamer 多聚体）。下面，我们以小鼠脾脏样本为例，分享利用 CD3 / CD28 Streptamer® 激活扩增 T 细胞的实验原理、实验步骤与实验结果。

实验原理

使用低亲和力的抗 CD3 和抗 CD28 的抗体 Fab 片段（非传统全长抗体），结合上 Twin-Strep-tag 亲和标签，形成 CD3 Fab-Strep 和 CD28 Fab-Strep。再结合可溶性蛋白多聚体 Strep-Tactin®，在亲和力作用下，即可与 TCR 和 CD28 共刺激受体多价结合，来传递激活信号。该方法最大的优势是在刺激过程中，能够通过加入 biotin 移除刺激试剂，达到精确掌控活化时间的目的。

实验步骤

1、小鼠脾脏淋巴细胞的分离（次日）

（1）研磨：将 70 μm 细胞筛网置于培养皿中，取小鼠脾脏放置于筛网中，加入 5 ml 达优小鼠淋巴细胞分离液，对脾脏轻轻进行研磨（注：此步操作要快，避免分离液蒸发）；

（2）转移：把悬有脾脏细胞的的分离液立即转移至 15 ml 离心管中，随后在分离液上层轻轻覆盖 500～1,000 μl 的 RPMI 1640 培养基（保持分离液与培养基分界明显）；

（3）离心：室温，水平转子 800 g 离心 30 分钟，设置离心机为缓升缓降；

（4）收集：离心结束后吸出淋巴细胞层（白膜层），加入 10 ml RPMI 1640 洗涤一遍细胞，250 g 离心 10 分钟收集细胞；

（5）扩增：将上一步离心得到的细胞沉淀，重悬至扩增培养基中，并进行计数。

2、T 淋巴细胞的刺激

（1）孵育：将 CD3 Fab-Strep、CD28 Fab-Strep、Strep-Tactin® Multimer 按照 1:1:1 的比例进行混合，4°C 孵育 20 分钟，期间进行连续搅拌，如果是在静置条件下孵育中间进行几次吹打混匀，该孵育时间可适当延长。孵育结束制备得到 CD3 / CD28 Streptamer® 混合物；

（2）混合：用培养基（成分：RPMI 1640 + 10% 血清 + 50 U/ml IL-2 ）调整细胞浓度至 5 × 105/ml，将制备好的 CD3 / CD28 Streptamer® complexes 与细胞悬液进行混合，轻轻吹匀后，将细胞加入到细胞培养板中，放置于 37°C 含 5% CO2 细胞培养箱中培养。细胞数量、培养基体积、多聚体用量配比参考以下表格：

细胞培养板	96 孔板	48 孔板	24 孔板
T 细胞数量	5～8 × 104	2～5 × 104	0.5～1 × 106
培养基体积（ml）	0.1～0.2	0.5～1	1～2
CD3 / CD28 Streptamer premix（μl）	3	15	30

（3）培养：培养过程中，每天观察细胞的状态，是否形成克隆团，或进行细胞计数，如果出现培养基变黄或细胞密度过高的情况，吹散细胞克隆团后调整细胞密度至 0.5～1 × 106/ml，更换培养板和培养基；

（4）移除 CD3 / CD28 Streptamers 终止刺激（该步根据实验需求可选做）：直接向刺激后的细胞悬液中加入终浓度为 1 mM 的 Biotin，室温孵育 30 分钟。收集并转移细胞至 15 ml 离心管中，加入 10 ml 培养基，300 g 离心 6～10 分钟，弃上清，再次加入 10 ml 培养基重复一遍洗涤步骤，至此，细胞已经可以用于下游分析。

注：如果选择提前富集 T 淋巴细胞，建议使用阴选试剂盒或可以去除分选试剂的阳选试剂盒

实验结果

1. 扩增 3 天形成细胞克隆团