流动相的选择与储存

赵敏 0 2022-05-26

分享到

在色谱分析中，流动相必不可少，流动相对实验结果的准确性也有着非常大的影响，如何选择流动相？流动相该如何存储？这都是考验实验人员的大问题。今天咱们就聊一聊流动相的选择和储存的小技巧。

在流动相选择上首先要看所要检测样品的性质，高效液相根据色谱柱的不同分为反相和正相，常用的C18柱、C8柱为反相柱，一般反相是首选，流动相的极性大于色谱柱的极性，流动相由极性较大的水和极性较小的有机溶剂（常用的是乙腈、甲醇）按照一定的比例配制而成。

当样品为强亲水性样品时，流动相中含水时，在色谱柱上保留很弱，需采用非水反相色谱。

当样品为强疏水性样品时，流动相中含水时，在色谱柱上保留很强，需采用正相色谱。正相色谱时，流动相比例极性小于色谱柱的极性，流动相由非极性的正己烷和极性较大的有机溶剂（二氯甲烷、丙醇、异丙醇、甲基叔丁基醚等等）按照一定的比例配制而成。

流动相选择的3大秘诀

秘诀1

由强到弱：一般先用90%的乙腈(或甲醇)/水(或缓冲溶液)进行试验，这样可以很快地得到分离结果，然后根据出峰情况调整有机溶剂(乙腈或甲醇)的比例。

秘诀2

三倍规则：每减少10%的有机溶剂(甲醇或乙腈)的量，保留因子约增加3倍，此为三倍规则。这是一个聪明而又省力的办法。调整的过程中，注意观察各个峰的分离情况。

秘诀3

粗调转微调：当分离达到一定程度，应将有机溶剂10%的改变量调整为5%，并据此规则逐渐降低调整率，直至各组分的分离情况不再改变。

乙腈和甲醇的比较

常用做反相流动相的溶剂是甲醇和乙腈，甲醇有其性价比的优势，但是甲醇活性高，可能与某些样品发生反应，而且甲醇在低波长下有紫外吸收，会降低分析方法的灵敏度；

乙腈虽然价格很高，毒性比甲醇大，但是洗脱能力比甲醇强，很少与样品发生反应，用作流动相系统常用做反相流动相的溶剂是甲醇和乙腈，甲醇有其性价比的优势，但是甲醇活性高，可能与某些样品发生反应，而且甲醇在低波长下有紫外吸收，会降低分析方法的灵敏度；

乙腈截止波长比甲醇低20nm，增加了检测出在低波长下才有吸收的杂质的可能性，所以我们一般倾向于多用乙腈，少用甲醇。但是有时候样品峰形不好或者分离不好，更换溶剂试试是一个很好的选择，毕竟不同的溶剂提供不同的选择性。

对流动相的优化主要在水相上下功夫，水里可以加酸、加碱、加盐，从而改善峰形、提高分离度。流动相里加碱的情况比较少，主要还是加酸，常用的酸有磷酸、三氟乙酸、甲酸、乙酸、高氯酸、甲基磺酸等，其中最常用的是磷酸和三氟乙酸，磷酸在低波长下没有紫外吸收，而三氟乙酸在低波长下有，但是三氟乙酸易挥发而磷酸不行，所以单纯做液相，低波长下磷酸最合适，三氟乙酸有吸收，运行梯度时基线漂移很严重，而做液质就要考虑首选三氟乙酸了，近些年还比较流行加甲酸或乙酸。一般情况下这几种酸没有太大区别，我们更多的是考虑通过加酸改变流动相的pH值，从而改善样品的分离度和峰形。

缓冲盐的选择

在单独用酸不行的时候就要考虑使用缓冲盐，缓冲盐的选择原则是：简单、稳定、缓冲能力强、配制简单，需要调pH值时要有相应的酸或碱。常用的缓冲盐是磷酸盐，主要是钾盐和钠盐，再有就是醋酸盐，常用的盐浓度在10~20mM左右。以前因为色谱柱填料生产工艺的问题，往往需要在流动相里添加三乙胺来减少拖尾，但是三乙胺对色谱柱的寿命有很大影响，现在新的色谱柱都不再需要了。流动相里有时会需要调节pH值到碱性，具体pH要视色谱柱的耐受范围而定，常用 NaOH、KOH溶液或氨水做为调节缓冲盐溶液碱性pH的试剂，也可以往水里单独添加氨水做碱性流动相。

在缓冲盐做流动相时，出峰太早、峰形很差、相似结构的化合物峰因为拖尾或峰型太宽而不能达到基线分离时，可以考虑使用离子对试剂，常用的离子对试剂主要是各种烷基磺酸钠和四丁基铵盐，但是流动相里使用离子对试剂时，系统需要的平衡时间长，样品保留时间不是很稳定，因为离子对试剂的背景吸收基线会很差，且做完样品后需要长时间清洗，所以我们尽量不使用离子对试剂。

使用缓冲盐时要注意流动相混合以后盐可能析出的问题和盐背景吸收导致基线漂移严重的问题，尤其是在流动相里添加醋酸铵以后，在低波长下梯度变化时基线下降非常严重，严重影响对含量较小杂质的准确定量，可以考虑在乙腈里加入10%的水，水中预先加入10倍水溶液浓度的缓冲盐，这样梯度中A、B两项盐的浓度相同，可以避免基线漂移严重的问题。

选择流动相需要考虑啥？

理想的液相色谱流动相溶剂应具有低粘度、与检测器兼容性好、易于得到纯品和低毒性等特征。选择流动相时应考虑以下几个方面：

1、流动相应不改变填料的任何性质。低交联度的离子交换树脂和排阻色谱填料有时遇到某些有机相会溶胀或收缩，从而改变色谱柱填床的性质。碱性流动相不能用于硅胶柱系统。酸性流动相不能用于氧化铝、氧化镁等吸附剂的柱系统。

2、纯度。色谱柱的寿命与大量流动相通过有关，特别是当溶剂所含杂质在柱上积累时。

3、必须与检测器匹配。使用UV检测器时，所用流动相在检测波长下应没有吸收，或吸收很小。当使用示差折光检测器时，应选择折光系数与样品差别较大的溶剂作流动相，以提高灵敏度。

4、粘度要低(应<2cp)。高粘度溶剂会影响溶质的扩散、传质，降低柱效，还会使柱压降增加，使分离时间延长。最好选择沸点在100℃以下的流动相。

5、对样品的溶解度要适宜。如果溶解度欠佳，样品会在柱头沉淀，不但影响了纯化分离，且会使柱子恶化。

6、样品易于回收。应选用挥发性溶剂。

责任编辑：展源

审　　核：何发

流动相的选择与储存

相关文章