蛋白质纯化方法一次性搞定，记得收藏噢

赵桂芝 0 2021-12-09

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蛋白质结构复杂，实验人员是如何区分，分离纯化这些蛋白质的呢？蛋白质纯化有哪些方法？机理是怎么样的？跟小析姐一起来get新知识吧。

能从成千上万种蛋白质混合物中纯化出一种蛋白质的原因,是不同的蛋白质在它们的许多物理、化学和生物学性质有着极大的不同,这些性质是由于蛋白质的氨基酸的序列和数目不同造成的,连接在多肽主链上氨基酸残基可是荷正电的、荷负电的、极性的或非极性的、亲水的或疏水的,此外多肽可折叠成非常确定的二级结构(α螺旋、β折叠和各种转角)、三级结构和四级结构,形成独特的大小、形状和残基在蛋白质表面的分布状况,利用待分离的蛋白质与其他蛋白质之间在性质的差异,即能设计出一组合理的分级分离步骤。可依据蛋白质不同性质与之相对应的方法将蛋白质混合物分离。

分子大小

不同种类的蛋白质在分子大小方面有一定的差别,可用一些简便的方法,使蛋白质混合物得到分离。

(1)透析和超滤

透析在纯化中极为常用,可去除盐类(脱盐及置换缓冲液)、有机溶剂、低分子量抑制剂等。超滤一般用于浓缩和脱色。

(2)离心分离置换缓冲液

许多酶富集于某一细胞器内,匀浆后离心得到某一亚细胞成分,使酶富集10-20倍,再对特定的酶进行纯化。差速离心,分辨率较低,仅适用于粗提或浓缩。速率区带法,如离心时间太长所有的物质都会沉淀下来,故需选择最佳分离时间,可得到相当纯的亚细胞成分用于进一步纯化,避免了差速离心中大小组分一起沉淀的问题,但容量较小,只能用于少量制备。等密度梯度离心常用的介质有蔗糖、聚蔗糖、氯化铯、溴化钾、碘化钠等。

(3)凝胶过滤

这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一,注意使要分离的蛋白质分子量落在凝胶的工作范围内。选择不同的分子量凝胶可用于脱盐、置换缓冲液及利用分子量的差异除去热源。

形状

蛋白质在离心通过溶液运动时,或通过膜、凝胶过滤填料颗粒或电泳凝胶中的小孔运动时,都会受到形状的影响。对两种相同质量的蛋白质而言,球状蛋白质具有较小的有效半径(斯托克半径),通过溶液沉降时遇到的摩擦力小,沉降较快而显得比其它形状的蛋白质大;反之,在体积排阻色谱时,斯托克半径较小的球状蛋白质更容易扩散进入凝胶过滤填料颗粒内部,较迟洗脱出来,因而显得比其它形状的蛋白质要小。

溶解度

利用蛋白质的溶解度的差别分离各种蛋白质常用的方法。影响蛋白质溶解度的外界因素很多,其中主要有:溶液的pH、离子强度、介电常数和温度,但在同一的特定外界条件下,不同的蛋白质具有不同的溶解度。适当改变外界条件,控制蛋白质混合物中某一成分的溶解度。

(1)pH控制和等电点沉淀

蛋白质在其等电点一般较不易溶解。

(2)有机溶剂分离法

蛋白质在不同的溶剂中的溶解度有很大不同,从基本不溶(<10ug/ml)直至极易溶解(>300mg/ml)不等。引起蛋白质沉淀的有机溶剂的浓度不同,故控制有机溶剂的浓度可分离蛋白质。水溶性非离子聚合物如聚乙二醇也能引起蛋白质的沉淀。

(3)温度

不同的蛋白质在不同的温度具有不同的溶解度和活性。大多数蛋白质在低温下比较稳定,故分离操作一般在0℃或更低温度下进行。

电荷

蛋白质净电荷取决于氨基酸残基所带的正负电荷的总和,如中性溶液中带净负电荷则称为酸性蛋白质。

(1)电泳

不仅是分离蛋白质混合物和鉴定蛋白质纯度的重要手段,而且也是研究蛋白质性质很有用的方法。等电聚焦分辨率很高,pI有0.02pH的差异就能分开。2D-PAGE分离蛋白质分辨率已经发展到100000个蛋白点。

(2)离子交换层析

改变蛋白质混合物溶液中的盐离子强度、pH和(阴、阳)离子交换填料,不同蛋白质对不同的离子交换填料的吸附容量不同,蛋白质因吸附容量不同或不被吸附而分离。

洗脱可采用保持洗脱剂成分一直不变,也可采用改变洗脱剂的盐度或pH的方法洗脱,后一种可分为分段洗脱和梯度洗脱。梯度洗脱一般效果较好,分辨率高,特别是交换容量小,对盐浓度敏感的离子交换剂,多用梯度洗脱。控制洗脱剂的体积(与柱床体积相比)、盐浓度和pH,样品组分能从离子交换柱上分别洗脱下来。

疏水性

多数疏水性的氨基酸残基藏在蛋白质的内部,但也有一些在表面。蛋白质表面的疏水性氨基酸残基的数目和空间分布决定了该蛋白质是否具有与疏水柱填料结合从而利用它来进行分离的能力。因其廉价和纯化后的蛋白质具有生物活性,是一种通用性的分离和纯化蛋白质的工具。高浓度盐水溶液中蛋白质在柱上保留,在低盐或水溶液中蛋白质从柱上被洗脱,故特别适用于浓硫酸铵溶液沉淀分离后的母液以及该沉淀用盐溶解后的含有目标产品的溶液直接进样到柱上,当然也适用7mol/L盐酸胍或8mol/L脲的大肠杆菌的治疗蛋白质提取液直接进样到柱上,在分离的同时也进行了复性。

亲和能力

结合效率高,分离速度快的特点。配基可以是酶的底物、抑制剂、辅因子、特异性的抗体。吸附后可改变缓冲液的离子强度和pH的方法,洗脱下来,也可用更高浓度的同一配体溶液或亲和力更强的配体溶液洗脱。按配基的不同可分为:

(1)金属螯合介质

过渡金属离子Cu2+、Zn2+和Ni2+等以亚胺络合物的形式键合到固定相上,由于这些金属离子与色氨酸、组氨酸和半胱氨酸之间形成了配价键,从而形成了亚胺金属-蛋白螯合物,使含有这些氨基酸的蛋白被这种金属螯合亲和色谱的固定相吸附。螯合物的稳定性受单个组氨酸和半胱氨酸解离常数所控制,从而亦受流动相的pH和温度的影响,控制条件可以使不同蛋白质相互分离。

(2)小配体亲和介质

配体有精氨酸、苯甲酰胺、钙调因子、明胶、肝素和赖氨酸等等。

(3)抗体亲和介质

即免疫亲和层析,配体有重组蛋白质A和重组蛋白G,但蛋白A比蛋白G专一,蛋白G能结合更多不同源的IgG。

(4)颜料亲和介质

染料层析的效果主要取决于染料配基与酶的亲和力大小外,还与洗脱缓冲液的种类、离子强度、pH值及待分离样品的纯度有关。配体有Cibacron Blue和Procion Red两种。在一定的条件下,固定化的染料能起阳离子交换剂的作用,为了避免此现象的发生,最好要离子强度小于0.1和pH大于7时操作。

(5)外源凝集素亲和介质

配体有刀豆球蛋白、扁豆外源凝集素和麦芽外源凝集素,固相外源凝集素能和数种糖类残基发生可逆反应,适合纯化多糖、糖蛋白。

稳定性

(1)热稳定性

大多数蛋白质加热到95℃时会解折叠或沉淀,利用这一性质,可容易地将一种经这样加热后仍保持其可溶性活性的蛋白质从大部分其他细胞蛋白质中分离开。

(2)蛋白酶解稳定性