漫谈实验照妖镜：凝胶成像仪
凝胶成像
随着分子生物学研究逐步普及,凝胶成像系统在国内的需求在不断增长不管是什么用途,凝胶成像系统的组件都是相似的。都有一个拍摄系统、一个带有特殊光源的暗箱与获取和分析凝胶图片的软件组成。”但是,大部分凝胶成像系统提供了不同的产品特性来满足不同科学研究的需要。快速发展的电子技术、光学技术和成像分析软件使成像操作越趋人性化。
随着分子生物学研究逐步普及,凝胶成像系统在国内的需求在不断增长不管是什么用途,凝胶成像系统的组件都是相似的。都有一个拍摄系统、一个带有特殊光源的暗箱与获取和分析凝胶图片的软件组成。”但是,大部分凝胶成像系统提供了不同的产品特性来满足不同科学研究的需要。快速发展的电子技术、光学技术和成像分析软件使成像操作越趋人性化。
凝胶成像系统是一个集观察、拍摄和分析凝胶于一体的凝胶分析系统。使用该系统可以对凝胶进行定量和定性分析。
凝胶成像系统是实验室常用的一种仪器,其应用范围极其广泛。总的来说,凝胶成像系统可以用于:蛋白质、核酸、多肽、氨基酸、多聚氨基酸等其他生物分子的分离纯化结果作定性分析;确定生物分子的分子量;用于生物分子的定量分析。
样品在电泳凝胶或者其他载体上的迁移率不一样,以标准品或者其他的替代标准品相比较就会对未知样品作一个定性分析。这个就是图像分析系统定性的基础。根据未知样品在图谱中的位置可以对其作定性分析,就可以确定它的成份和性质。
样品对投射或者反射光有部分的吸收,从而照相所得到的图像上面的样品条带的光密度就会有差异。光密度于样品的浓度或者质量成线性关系。根据未知样品的光密度,通过于已知浓度的样品条带的光密度指相比较就可以得到未知样品的浓度或者质量。这就是图像分析系统定量的基础。采用最新技术的紫外透射光源和白光透射光源使光的分布更加均匀,最大限度的消除了光密度不均造成的对结果的影响。
具体从使用分析的角度来看,凝胶成像系统可以应用于分子量计算,密度扫描,密度定量,PCR定量等生物工程常规研究。
对于一般常用的DNA胶片,利用分子量定量功能,通过对胶上DNA Marker条带的已知分子量注释,自动生成拟合曲线,并以它衡量得到未知条带的分子量。通过这种方法所得到的结果较肉眼观察估计要准确很多。此方法也适用于对PAGE蛋白胶条带的分子量测定。
一般常用的测定DNA(脱氧核糖核酸)和RNA(核糖核酸)浓度的方法是紫外吸收法,但它只能测定样品中的总核苷酸浓度,而不能区分各个长度片段的浓度。利用凝胶成像系统和软件,先将DNA胶片上某一已知其DNA含量的标准条带进行密度标定以后,可以方便的单击其他未知条带,根据与已知条带的密度做比较,可以得到未知DNA的含量。此方法也适用于对PAGE蛋白胶条带的浓度测定。
在分子生物学和生物工程研究中,常用到的是对蛋白表达产物占整个菌体蛋白的百分含量的计算。传统的方法是利用专用的密度扫描,但利用生物分析软件,结合白光照射的凝胶成像获取图片,就能完成此项工作。
PCR定量主要是指,如果PCR实验扩增出来的条带不是一条,那么可以利用软件计算出各个条带占总体条带的相对百分数。就此功能而言,与密度扫描类似,但实际在原理上并不相同。PCR定量是对选定的几条带进行相对密度定量并计算其占总和的百分数,密度扫描时对选择区域生成纵向扫描曲线图并积分。
适用于对蛋白凝胶电泳(考马斯染色,银染)等可见光样品,以及DNA/RNA(EB、TLC plates、SYBR Green)等紫外;进行图象采集并进行定性和定量分析;
适用于化学发光/紫外光/可见光凝胶成像分析系统,如ECL、ECL PLUS、Southern、CDP Star、CSPD、Northern和Western杂交的化学发光等各种化学发光暴光后的样品检测
适用于荧光/化学发光/可见光凝胶成像分析系统,如:EB 、TLC plates、GFP plates、SYBR Green、SYBR Gold、SYBR Safe、Sypro Red、Sypro Orange、Texas Red、Rhodamine Red、Fluorescein、Deep Purple、Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、荧光板等的样品检测;
适用于生物发光(bioluminescence)与荧光(fluorescence)两种技术。生物发光是用荧光素酶(luciferase)基因标记细胞或DNA,而荧光技术则采用荧光报告基团(GFP、RFP),或 Cyt及dyes等荧光染料进行标记。
凝胶成像系统的基本骨架包含:CCD相机,暗室和分析软件。其不仅对琼脂糖凝胶进行成像,还适用于蛋白胶、发荧光的胶、印迹膜和菌落平板等应用。在Western Blot方面,高性能的CCD分子成像系统能与胶片媲美。
CCD是电荷耦合器件(Charge Coupled Device)的英文名称缩写,是一种光电转换器件,是凝胶图像系统的核心部件。有人把数码相机的像素看得很重,但比较之后发现,有些400万、500万像素的相机拍出来的片子没有300像素的机子拍出来的好,这是为什么?
衡量CCD好坏的指标,有分辨率,CCD尺寸,动态范围,灵敏度,量子效率,信噪比等,其中像素数以及CCD尺寸是重要的指标。CCD感光器件的面积越大,捕获的光子越多,感光性能越好,信噪比越低。
为了方便您更了解CCD的大小,现列举目前市场上所应用的CCD规格如下:
1英寸 ——靶面尺寸为宽12.7mm*高9.6mm,对角线16mm。
2/3英寸——靶面尺寸为宽8.8mm*高6.6mm,对角线11mm。
1/2英寸——靶面尺寸为宽6.4mm*高4.8mm,对角线8mm。
1/3英寸——靶面尺寸为宽4.8mm*高3.6mm,对角线6mm。
1/4英寸——靶面尺寸为宽3.2mm*高2.4mm,对角线4mm。
CCD的分辨率由低到高:从45万左右,100万左右,140万左右,200万左右,300万左右,400万左右,500万左右,甚至还有更高的,根据CCD的温度有可以分为常温CCD相机和制冷CCD相机,制冷CCD:热或者暗电流对于CCD都是噪音,噪音在冷CCD基本都可以被深度致冷的Peltier消除。在曝光超过5-10秒,CCD芯片就会发热,没有致冷设备的芯片,“热”或者白的像素点就会遮盖图像,图像到处可见雪花。CCD结构设计、数字化的方法等都会影响噪音的产生。当然通过改善结构、优化方法,同样能减少噪音的产生。
制冷CCD的适用性:荧光及化学发光本身较弱,所以对CCD噪音的降低要求很高,应选用高分辨率数字冷却CCD相机结合高通透镜头系统,使其能够捕获到信号极其微弱的荧光及化学发光样品图像,并且能够最大程度的降低噪音,减少背景,提供出色的图像清晰度。另外可选激发光源及多位滤镜轮扩大了荧光/化学发光成像的应用范围。所以一般在荧光及化学发光观察时需要选择制冷CCD。所以制冷CCD相机绝对是高端分子影像成像分析系统的未来的发展趋势和必须要求。
分辨率的大小和像素值是分不开的,像素指得是CCD能分别的最小的感光元件,我们平时说的多少万像素就是这些感光元件的个数了。所以一般来讲像素越多,成像也就越清晰细腻,当然这其中还要受许多因素限制。高像素也不一定是好的CCD,其原因就是像素大小(Pixel Size),也是很重要的因素,相同数目的像素,排列越密集,像素之间就越容易出现电流干扰,容易出现"噪点"等干扰成像质量的现象出现。由于制造工艺的限制,增加尺寸,成本将会以几何级数提高。
现在大部分厂家的CCD为了提高图像的灵敏度,会使用像素合并的技术,那么像素合并的意义是什么呢?像素合并是一种非常有用的功能,它可被用来提高像素的大小和灵敏度。
动态范围表示在一个图像中最亮与最暗的比值。灰阶表示在一种表征光亮度的方法,bit值越高能分出的细微差别越大。值得一提的是,目前来说,市场上主流的凝胶成像的CCD以12bit为主,16bit的仪器一般情况下,分辨率均在200万像素左右,对于真正的16bit,而像素值又近400万的CCD是非常少见的。对动态范围进行量化需要一个运算公式,即动态范围值 = 20 log (well depth/read noise),其中Well depth代表是满井电子,是CCD饱和时能接受的电子信号总值,read noise是读出噪声(以电子数来表示),每个CCD在读数的过程中都会产生噪声,噪声越小,监测灵敏度越高。其中满井电子与CCD的bit值是相关的,通常下,bit值越高,满井电子的数值越大。动态范围的值越高CCD性能越好。
CCD的量子效率也称像素灵敏度,指在一定的曝光量下,像素势阱中所积累的电荷数与入射到像素表面上的光子数之比。不同结构的CCD其量子效率差异很大。比如100光子中积累到像素势阱中的电荷数是50个,则量子效率为50%(100 photons = 50 electrons means 50% efficiency)。值得注意的是CCD 的量子效率与入射光的波长有关。
暗电流是导致CCD噪音的很重要的因素。暗电流指在没有曝光的情况下,在一定的时间内,CCD传感器中像素产生的电荷。我们在做化学发光检测的时候,需要的曝光的时候比较长,这样导致CCD产生较多的暗电流,对图像的质量影响非常大。通常情况下通过降低CCD的温度来最大限度的减少暗电流对成像的影响。暗电流与温度的关系,CCD产生的暗电流随着温度下降而减少,但是在-23℃下曲线开始趋于平缓,由此可以看出温度并非需要无休止的降低的。所以在选择冷CCD时,温度在-25℃下一般就可以达到要求了。
有的CCD是在图像最终生成后,通过软件去背景来扣除暗电流,对于信号远远强于背景的有一定效果,但是对于弱信号处理过程中会产生越来越多的错误。
光学镜头是机器视觉系统中必不可少的部件,直接影响成像质量的优劣,影响算法的实现和效果。光学镜头规格繁多,有时不免头晕。光学镜头从焦距上可分为短焦镜头、中焦镜头,长焦镜头;从视场大小分有广角、标准,远摄镜头;结构上分有固定光圈定焦镜头,手动光圈定焦镜头,自动光圈定焦镜头,手动变焦镜头、自动变焦镜头,自动光圈电动变焦镜头,电动三可变(光圈、焦距、聚焦均可变)镜头等。
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SYBR Green、SYBR Gold、SYBR Safe、SYPRO Orange、Cy2等
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Texas Red、Rhodamine Red 、Cy5等
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凝胶成像仪都是由硬件和软件所组成,两者是不可分割的。硬件设备再好,如果不配上好的软件,也无法发挥它应有的功能。作为凝胶成像系统软件功能和用途都基本相似,这里我们介绍一下最关注的几个特点:
A、软件的基本功能:可对不同样品,如条带,斑点,细菌克隆,芯片,细胞或者活体动物等,进行定性、定量分析,加批注,输出图像等操作。
B、图像采集方式:对于化学发光或多色荧光产品,软件应具备电影模式,可以进行图像多祯累计功能来增强线性动态范围和数据准确度。
C、操作简便,软件应具备操作辅助工具,使软件操作更简单易用。最好采用三步式泳道及条带分析可以快速计算蛋白质和核酸的分子量及含量。
D、数据库功能也是必不可少的,这样可以检索、分类或比较所有生成的图像。可利用不同的显示算法程序图像化显示条带差异。
E、曝光方式:应采用单一曝光、多重曝光,累计曝光,延时(定时)曝光多种模式可选。
F、记忆功能:软件能记忆并自动调用成像数据,这样你不用每次设置就能获得重复性好的结果。
G、软件应配备两套以上,使用单机版,多用户版或网络版,用户可彼此独立操作,互不干扰,互不混淆。
当然有DEMO机的,这条可以忽略。我们对比不同厂商的参数时一定要注意只比关键的,而对那些无关痛痒的参数则大可以视而不见。
对于扫描成像而言,灵敏度一般不是问题,我们关注的应该是分辨率,当然分辨率只要达到我们的要求即可,对于小型的凝胶、膜和微孔板来说,一般分辨率在25um左右应该是足够了。在满足分辨率后,一个更重要的参数摆在我们的面前,那就是动态范围,简单的说,动态范围决定着你能否同时在一张胶上同时看到强的信号和弱的信号,而且他们之间保持比较好的定量关系。一般动态范围采用数量级来表示,这个数越大,表明动态范围越宽。对于激光扫描成像系统,情况就复杂一些。从激光器、滤光片到分光镜和检测器还有好多需要考虑和比较的。
下面主要介绍实验室常用的凝聚成像仪的参数选择。根据原则一,如果您主要用它来拍普通核酸胶或蛋白胶,那么几乎市场上所有的成像仪都可以很好的满足您的需求,这时除了价格这个决定因素外,能比较的也就是一些诸如“操作是否简便、外形是否时尚”等无关痛痒的指标了。真正需要花心思考察的可能就是准备做化学发光的用户,他们对敏感度要求高,同时还要求比较宽的动态范围。
要想捕获到微弱的化学发光,需要上佳的CCD相机和镜头。一般来说,CCD相机的冷却温度和背景噪音息息相关,温度越低,噪音就越低。因此,-25℃的制冷温度是对相机的基本要求(更低的温度,噪音降低效果不明显,而量子效率又会受很大影响);另外,较大的像素能够提供更高的捕光效率;所以对于相同大小的CCD芯片,需要注意像素的尺寸。
镜头的参数就简单了,由于我们只需要观察近距离的样品而且一般可以调整样品位置(有些厂家甚至提供电动样品升降平台),所以基本无需选择长镜头或者变焦镜头;但是,由于我们需要检测微弱的化学发光,镜头的光圈则至关重要,一般F值越小,其通光量越大,而且成平方反比关系,因此我们一般需要选择光圈F值尽量小的镜头。另外,如果镜头是电动的,我们可以省却打开机箱,反复手工调整光圈和聚焦等的烦恼。
其他我们需要考虑的包括光源、滤光片和暗箱等部件。光源的种类和发光的均一度,滤光片的数量和暗箱的遮光效果等均在我们的考虑范围之内。当然,一般如果成像仪的CCD和镜头配置不错,一般这些部件也不会太差。
市场上各品牌、各型号的成像仪林林种种,但是从成像原理上可以分成两大类,分别是拍照成像和扫描成像。
拍照成像简单说就是样品和相机的相对位置不动,可以进行单次成像或多次成像;扫描成像则是相机对样品进行局部成像,然后通过样品或相机的移动对整个样品进行成像。
拍照成像目前主要采用CCD相机成像,由于可以设置不同的曝光时间,常被用来进行微弱的化学发光及生物发光的成像。而扫描成像则由于精度高、重复性好被广泛用于大型样品以及多通道成像中。可以说,对于大型样品或多通道应用,能选择扫描成像的,尽量不要选择拍照成像。
原理搞清楚了,选择起来就简单了。不同的原理导致了不同应用的佳选择,所以千万不要相信什么“全能王”之类的鬼话,没有任何一款机器可以通吃所有应用领域。下面就实验室常见的一些应用简单的说明选择的依据:
(1)核酸电泳凝胶:一般此类凝胶都采用EB染色、紫外激发,而且凝胶较小。推荐采用一般的凝胶成像设备即可完成。
(2)蛋白电泳凝胶:一般此类凝胶采用考染或银染,白光透射成像。对于小型凝胶您可以选择一般的凝胶成像设备,但是对于大型凝胶,特别是双向电泳凝胶,由于CCD拍照成像会有几何扭曲,而且透镜效应也会导致不同区域的信号强度差异,另外CCD拍照也无法保证不同凝胶的成像参数保持一致,因此扫描成像是好选择。
(3)转印膜:这个稍微有些复杂。一般转印膜有比色法显色、同位素、化学发光和荧光等不同检测手段。
比色法显色就是产生有颜色的条带或斑点,一般采用普通的凝胶成像设备即可。
同位素可以采用压胶片曝光的方法,但是费时、费力而且容易过饱和。
比较通用的方法是由FujiFilm在1981年发明的磷屏成像技术,获得信号潜影的磷屏通过激光扫描就可以获取同位素的信号。而化学发光是目前常用的蛋白印迹的检测手段,无疑,冷CCD拍照成像对这种微弱的光信号是合适的。
荧光是所有这些检测手段中令人赞叹的和有前景的。这不仅仅是因为荧光染料具有宽的动态范围,而且还在于它能够为我们提供多通路的检测途径(同样适用于凝胶)。当然,您可以使用单一荧光检测,这时您对凝胶成像设备的要求就包括了新的激光光源和相应的滤光片。如果您是一个完美主义者,或者您需要对邻近或重叠的目标分子进行成像,那么多通道荧光检测是您的不二之选。这时扫描成像是佳选择,这样选择不仅仅是因为扫描成像能够带来更高的灵敏度和分辨率,更重要的是,不同通道 之间没有几何扭曲,拟合性好。
微孔板及其他特殊需求:对于拍照成像而言,由于几何扭曲的问题,对微孔板成像就变得比较复杂了,一般必须一个专用的校正装置才可完成。当然,如果采用扫描成像一般不需要任何额外 附件。很多实验室现在都对小动物成像非常感兴趣,然而对小动物进行真的不是一件简单的事,一方面小动物需要进行麻醉和固定;另一方面还需要对信号位置进行三维定位。因此,能同时提供功能、代谢和解剖图像的PET/CT是进行这类成像的有力的工具。
好用才是硬道理。任凭你说得天花乱坠,拿来我试试,不就什么都清楚了。现在多数厂商都提供Demo机服务,还有技术人员现场答疑解惑,那就请各位上场,真刀真枪的拼一下,谁的性能好,价格优,那我就要谁的。
当然,我们的实际测试结果仅仅是针对我们自己的样品和现场demo的机器而已。我们不能据此对相关品牌和相关型号做太多评判。由于具体应用的限制、操作技巧的差异以及可能的仪器状态的区别,我们有可能没有给出公允的评价。但无论如何,这些讯息对我们采购者和使用者来说都是非常重要的。
很多用户认为,买来后摆在实验室使用的只是一台仪器而已。其实,事实远不是这样。买仪器来是为了使用,而能否用好,除了我们自己的聪明才智和勤学苦练之外,厂家的技术支持必不可少。因此,要买就买原厂货已经成为很多用户的共识,因为这样就可以享受到厂家现场技术支持和指导。
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