首先必须厘清关于参考测量程序的概念:
什么是参考测量程序?
一个被测变量(measurand)的参考测量测序程序(Reference Measurement Procedure,RMP)与常规测量方法相对,是指计量学上最高等级的分析方法,能以最高的准确度和精密度确定被测变量的靶值。
参考测量程序(RMP)发挥何种作用?
RMP是实现医学检验溯源性的一个关键组分,用于评价常规测量方法的正确度、用于校准以及对参考物质赋值。
建立RMP,促进医学检验的溯源性是为了什么?
医学检验的溯源性旨在减少方法偏倚、降低方法间的变异度、实现方法间检测结果可比。更具体地说,溯源性是为了(不限于以下内容):
1、促进患者的健康与生命安全。实验室出示准确的检测结果,有助于降低误诊的可能性以及不当治疗的概率,提升医疗质量。
2、减轻患者的医疗负担。同一检验项目的结果在不同实验室间准确可比,能够减少不必要的重复检验,节省患者的花费以及诊治时间。
3、增加临床医生、患者以及检验学科工作人员对检验工作的信心。实验室间结果准确可比能让临床医生和患者更有信心依赖检验结果,有助于检验结果在诊疗过程中的价值最大化。
4、实验室间准确可比的检验结果有利于检验项目参考区间的建立和应用,有助于临床指南的建立和临床应用。
5、帮助实验室通过质量认证。
正式开始讨论:
LC-MS/MS法应该作为蛋白质定量的参考测量程序吗?
多年来,基于LC-MS/MS的RMPs是实现小分子物质检验结果标准化的基石。但对于蛋白质,由于存在蛋白水解一致性和完整性的问题以及校准的复杂性,当前仅有少量的RMPs,其中包括针对HbA1c,C肽以及Aβ1-42的RMPs。
同时,鉴于LC-MS/MS法的高特异度,蛋白质的同种型、转录后修饰等关乎被测变量定义的问题也需要厘清。对此,蛋白质组和计量学领域的五个专家针对LC-MS/MS法是否比免疫方法更有优势作为蛋白质的RMPs发表了意见,并讨论了LC-MS/MS作为参考方法所面对的问题,以下内容参考Clinical Chemistry杂志2020年第12期的文章,标题为:Should LC-MS/MS Be the Reference Measurement Procedure to Determine Protein Concentrations in Human Samples?
1、相对于免疫方法,靶向质谱方法作为蛋白质的参考方法有优势吗?
全部专家持同意的意见。
1)LC-MS/MS不需要特定抗体试剂,有高选择性、高特异性、灵敏度等优点,能有效区分蛋白质的同种型(isoforms),蛋白的转录后修饰(PTMs)以及突变形式。
2)由于靶向质谱直接测定被测物的质荷比,使用同位素稀释校准系统(包含内部标准化和外部校准),容易实现国际单位制(SI)溯源。而免疫方法存在非特异抗体结合、自身抗体干扰等问题,这使其溯源性存在较大的挑战。
2、建立参考测量程序(RMPs)时,进行蛋白水解、通过肽段来定量蛋白质合适吗,还是只关注完整蛋白质分子的定量方式。
建立RMPs时两种方式都值得考虑,两种方式都存在优缺点。
1)对于当前大多数蛋白质的测量,通过肽段定量蛋白的方式更常用。这种方式下,蛋白水解步骤是分析变异的一大来源,因此保证蛋白水解过程的重现性很关键。对于RMPs,更应该控制此变异。因此使用肽段进行校准需要满足3个重要标准:所选肽段和标记的内标在蛋白水解过程是稳定的;必须证明所选肽段是纯的而且以等摩尔水解释放。
2)当重组蛋白和他们的标记类似物与内源性的蛋白性质相似时,可考虑用完整蛋白分子作为校准物。完整蛋白形式定量有助于衡量蛋白水解过程所带来的变异大小。也有学者提出,由于LC-MS/MS的高特异性,测定完整蛋白形式可能需要测定蛋白质的同种型以及转录后修饰等多种形式并将其相加,这是巨大的挑战。
3、开发参考测量程序时我们需要确定被测变量(measurand)。如果我们认为被测变量的确定需要定量信息(比如,质量浓度),基质的描述(比如,血浆),以及所涉及的化学物(比如,分析物),那么什么是一个蛋白水解辅助方法的被测变量呢?
对于该问题的意见不统一。
有学者认为,通过蛋白水解以肽段定量蛋白时,被测变量是所选的定量肽段。有的则认为被测变量是包含该肽段的所有蛋白形式(可能包括各种亚型、转录后修饰形式)的集合。这对于只有一个选定肽段的情况很好理解,但当选定多个肽段时,定量是基于一种假设,即所有选定肽段都代表相同的蛋白形式集合,能产生相同的定量。鉴于此,选择定量肽段时应该谨慎考虑。
4、基于靶向质谱定量蛋白质的参考方法,最合适的校准系统是什么?
5、我们如何确保基于质谱定量蛋白的参考测量程序的准确性呢?在方法开发和验证过程中需要包含特定的实验吗?
一方面,需要进行准确度验证的实验,比如回收试验;标准加入法;参考实验室室间比对等,实验人员应该充分评估所有潜在的偏倚来源。另一方面,RMP必须对被测变量有清晰的定义,有合适的具有溯源性的校准物质。
6、我们会一直需要液相色谱(LC)吗?
可能不会。LC是一种分离仪器,能降低样本复杂度和离子抑制效应,很长时间内会用于RMPs。但随着仪器进步,靶向MS也许可以无需联用 LC。而且其它分离技术比如毛细管电泳、离子淌度谱以及场流分离仪等的性能越来越好,也会得到更多应用。
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何发
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