实时荧光PCR技术的前世今生

赵敏 0 2021-03-26

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实时荧光PCR（real-time PCR）因其全封闭扩增，简单快速，重复性好，无扩增后处理以及易于自动化等优点，广受大家欢迎。在分子诊断领域中，实时荧光PCR方法应用广泛。那么实时荧光PCR技术是如诞生的呢？下面，小析姐就与大家一起了解大牛们是如何经过精密的研究一步一步探索出来这项技术。

PCR的发展历程

1983年

1983年美国科学家Kary Mullis发明PCR方法，用于放大扩增特定的DNA片段，可看作是生物体外的特殊DNA复制。

1985年

1985年，Cetus公司从温泉中分离的嗜热菌（Thermus aquaticus）株中纯化出耐热DNA聚合酶（后面简称Taq 酶）。该酶耐高温的性质极大地提高了PCR扩增的效率，使得PCR真正变为现实，为其自动化铺平了道路。但是PCR技术也有其相应的局限性，就是对扩增产物分析时需要开盖处理，容易造成污染。为了解决这一问题Russ Higuchi进行了一系列相关研究。

1992年

1992年，Higuchi在一次报告中提出了实时荧光定量PCR技术。通过检测溴化乙锭的含量实时监控整个PCR反应的进程。之后经过不断的研究，通过对PCR反应的数学函数关系、相应的算法以及对标准品的运用，就可以对待测样品中的目标基因进行准确定量。

1996年

1996年ABI公司推出世界上第一台定量PCR仪7700型。设备由荧光定量系统和计算机组成，通过荧光染料或荧光探针，对PCR产物进行标记跟踪，结合相应的软件对结果进行分析，可以实现计算待测样品的初始模板量。由此，实时荧光PCR技术开始更广泛的应用。

提到实时荧光PCR技术，首先映入你脑海的是不是TaqMan探针方法和染料方法？其实，实时荧光PCR技术比你想象的更丰富。下面就让小析姐带你进入实时荧光PCR的世界，一起领略这项技术的丰富多彩。

实时荧光PCR基本原理

目前的实时荧光PCR技术主要是基于荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer，FRET)的原理，一对合适的荧光物质可以构成一个能量供体 (donor) 和能量受体 (acceptor) 对, 其中供体的发射光谱与受体的吸收光谱重叠，当它们在空间上相互接近到一定距离(1~10 nm)时，激发供体而产生的荧光能量正好被附近的受体吸收，使得供体发射的荧光强度衰减，受体荧光分子的荧光强度增强。

图1 荧光共振能量转移原理图

实时荧光PCR技术种类

染料法

SYBR Green I是一种比较常见的荧光染料，可以非特异的结合双链DNA小沟，它可以嵌合进DNA双链，但不结合单链。当SYBR Green I在溶液面未结合双链DNA时，仅产生很少的荧光，当它结合双链DNA时，就发射出很强的荧光信号。由于SYBR Green I能和任何双链DNA结合，无法区分引物二聚体或非特异性扩增产物，一般需要配合熔解曲线分析来排除假阳性。

图2 SYBR Green I作用原理

TaqMan探针

TaqMan探针是一个与模板特异性结合的荧光探针，它的 5'端标记有荧光报告基团(Reporter, R)，3'端标记有荧光淬灭基团(Quencher, Q)。当探针完整的时候，荧光基团和淬灭基团距离很近，使得荧光基团发射的荧光被淬灭。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5'-3'外切酶活性会切割探针，释放的5'端报告基团游离于反应体系中，它不受 3'端荧光淬灭基团影响，荧光信号就可以被仪器检测，积累荧光。也可以说每扩增一条DNA链，就形成一个荧光分子，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成同步。该技术目前应用较为广泛，包括人或动物病原体检测、生物制品鉴定等领域。

图3 TaqMan探针作用原理

双杂交探针

双杂交探针(dual hybridization probe)实时荧光PCR就是在两条寡核苷酸杂交探针上分别标记荧光供体基团和荧光受体基团，两基团的激发光光谱有一定程度的重叠。对两条探针的要求是，其与靶核酸的杂交位置应相互邻近。当两条探针与靶基因同时杂交时，两个荧光基团靠得很近，其间的距离在1~10 nm(通常为1~5个碱基)，依据FRET原理，在供体基团一定波长的激发光作用下，发生能量传递，从而激发受体基团发射另一种荧光，荧光强度和PCR反应中DNA合成量成正比。由于两个不同的探针必须杂交到正确的靶序列时，才能检测到荧光，因此，该方法的特异性增强。

图4 双杂交探针作用原理

分子信标

分子信标(molecular beacon, MB)探针由两端分别共价标记有荧光基团和淬灭基团的单链DNA分子组成，分子信标的环部分和靶核酸互补，而探针的两头由于互补而成为茎。当分子信标为茎环结构时，淬灭基团和荧光基团距离很近，报告基团的荧光信号被淬灭基团吸收，从而抑制报告基团产生荧光。在PCR变性阶段，该探针的茎部打开形成一条单链，当溶液中存在特异性模板时，在复性阶段该探针即可与模板杂交，使得5'端荧光基团和3'端淬灭基团分离，荧光信号得以释放。该方法可以用于基因定量分析、疾病基因检测和诊断等。

图5 分子信标作用原理

蝎型探针

蝎型探针(Scorpions Probes)由探针、引物以及PCR终止子组成。探针部分和分子信标相似，也是5'端有一个荧光基团，3'端有一个淬灭基团，并且呈现茎环结构，与分子信标所不同的是，蝎形探针带有一段特异引物，可与相应的靶核酸结合，在Taq DNA聚合酶的作用下聚合延伸，得到扩增产物，而所带探针部分正好可以与延伸端的特异产物中互补序列杂交结合，因此，如有扩增存在，在不断变性复性过程中，蝎形探针即可不断与扩增子杂交，茎环结构打开，荧光基团不再被淬灭而被发射出来，荧光强度与扩增产物的含量呈正比。蝎形探针中特异探针序列呈环状结构，由一个不可扩增的单体即PCR终止子连接于PCR引物的5'端，PCR终止子可防止扩增蝎形探针的茎环部分。