图1.（a）六通阀在1号位置（上样位置），系统将样品上样进入填充柱；（b）六通阀在2号位置（进样位置），系统将填充柱吸附的样品洗脱进入分析色谱柱。

本实验采用一个预浓缩纯化样品的填充柱与一根分析高效液相色谱柱串联使用的方法定量分析饮用水样品中浓度范围为0.1~100pg/ml三嗪类除草剂混合物。该方法所采用的直接进样体积为20ml，EQuan环境分析系统所具有的大体积进样功能，省去样品离线浓缩处理过程，避免了工作量大且费用昂贵的固相萃取处理。

随着人们对环境中除草剂以及其他化学药物残留的毒性作用关注程度的增加，实现对饮用水以及食物中这些物质的准确检测的需要显得更加迫切。目前，高效液相色谱-串联质谱联用方法常规用于环境领域以及食品行业中的杀虫剂、除草剂残留物的定性定量分析；但是这种方法通常需要离线对样品进行大量费用昂贵且费时的预浓缩处理。为了达到联邦政府和国际相关机构设定的严格标准以及低检测下限的要求，我们开发了一种在线预浓缩、纯化分析方法，该方法能够提高分析检测的灵敏度、精确度以及实现无余伦比的高通量分析。

该在线纯化分析方法采用Thermo Scientific EQuanTM系统。该系统主要组成包括：1、一台配备ESI离子源的三重四极杆质谱仪；2、两个液相色谱四元泵；3、一个自动进样器；3、两根具有C18选择性的液相色谱柱（其中一根用于样品的预浓缩、纯化样品，另外一根用于样品的色谱分离分析）；4、一个连接在两色谱柱之间的六通阀，通过仪器系统软件控制六通阀。另外该方法采用一种称为逆能量变化分析（RER）的技术，使得在同一次进样分析的数据中就可以获得定量分析方面信息以及定性分析的子离子全扫描子质谱图。所获得的谱图能够为所分析目标化合物的确认提供更丰富的信息。这些子离子质谱数据可以通过标准谱库检索实现物质的鉴定分析，或者通过谱图中离子信号相对强度来消除“假阳性”（把存在的化合物误认为不存在的情况）样品的错误，实现确认特定化合物的存在。该方法对没有经过任何样品处理、离线浓缩的饮用水样品直接进样色谱分析。本应用参考资料提供对含除草剂的饮用水样品，分别采用1ml、5ml以及20ml进样体积，直接进样在线预浓缩比较分析方面信息。

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图2. 仪器方法设置窗口。

实验目的：在配备两高效液相泵、采用双色谱柱（一根是用于样品在线预浓缩、纯化的填充柱，另外一根是用于色谱分离分析的分析柱）的系统平台上，在样品的各种大进样体积条件下，直接进样分析比较实验。

实验条件

样品准备

在含0.1%甲酸的饮用水样品中溶解多种除草剂的混合物，混合物中包括莠灭净、莠去通、莠去津、扑灭通、扑草净、扑灭津、仲丁通、西草净、西玛津、草净津和去草净（所有除草剂化合物从Ultra Scientific公司购买，北金斯敦，罗德艾兰州，美国）。样品中各种除草剂的浓度分布在0.1~10pg/ml范围内。各种物质的标准校正液浓度依次分别取0.1 pg/ml、0.5 pg/ml、1.0 pg/ml、5.0 pg/ml和10.0pg/ml。

图3. 西玛津样品浓度为1pg/ml、进样体积分别为1ml、5ml和20ml时色谱图。

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高效液相系统

通过HTC PAL自动进样器（CTC分析仪器股份公司，Zwingen，瑞士） 分进样1ml、5ml、20ml所配饮用水样品以及空白水样品进入样品预浓缩填充色谱柱（Thermo Scientific Hypersil GOLD型号色谱柱，柱长：20mm，内径：2.1mm，填料粒径：12μm）。当样品完全通过样品定量环进入色谱柱后，六通阀的位置进行切换，确保样品能够从预浓缩、纯化填充柱反向流动进入分离分析色谱柱（Hypersil GOLD型号色谱柱，柱长：50mm，内径：2.1mm，填料粒径：3μm）；各种化合物经过分析色谱柱的分离分开后，进入质谱检测器部分 （所有过程如图1 a和 1b所示）。当所有化合物洗脱出后，六通阀接口位置重新回到初始状态。在系统重新平衡色谱柱到初始状态前，需要采用高比例有机相的流动相对所用的填充柱和分析色谱柱进行冲洗。六通阀的切换以及时间控制是通过计算机数据系统LCQUAN（赛默飞世尔公司，圣何塞，加利福尼亚，美国）。

针对不同的进样体积，液相色谱方法有细微的不同，输液泵的流速从1ml样品进样体积时的1ml/min到20ml样品进样体积时的5ml/min变化。由于样品从进样定量环到填充柱所需要的时间由流速决定，这种流速随着进样体积的变化方式保证高流速时分析时间短。控制分离分析色谱柱的液相色谱程序也采用同样的变化方式。该分析过程中采用两个高效液相泵，其中一个用于将样品从定量环中转移到填充柱，另一个用于将吸附在填充柱的化合物反向淋洗转移到分析色谱柱上进行分离。填充柱系统所采用Surveyor Plus液相色谱泵（赛默飞世尔科技公司，圣何塞，加利福尼亚，美国）；分析色谱柱系统采用一个Accela型超高效液相色谱泵系统（赛默飞世尔公司，圣何塞，加利福尼亚，美国）。

图4. 碰撞能量为25eV、变化范围值为20eV条件下，QED-MS/MS方法所获得的浓度为1pg/ml莠去津样品的Q3质谱图。

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系统采用配备一个5ml注射器的HTC型自动进样器，为了满足大体积进样体积的需求（>5ml），采用一种CTC型自动进样器的多进样序列的程序方法，该进样方法允许多次从10ml 样品瓶中取样、转移样品到同一定量环中的操作。例如样品进样体积为20ml时，可以采用2个装满同种样品的10ml的样品瓶，该程序方法可以实现从相临位置上两样品瓶中取样进样过程。

该方法在CTCTM型自动进样器软件中设置界面，显示可以从同一样品瓶进行多次取样进样功能。红色窗口着重标记显示用于控制从两个相临样品瓶取样次数的参数。该图中所示设置状态的总进样体积为20ml。

质谱系统

质谱分析采用配备ESI源的TSQ Quantum Access型三重四极杆质谱仪（赛默飞世尔公司，圣何塞，加利福尼亚，美国）。定性分析数据和定量分析数据在一次进样分析普通数据中同时获得。

表1. 质谱条件参数

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结果与讨论

图3所示除草剂西玛津在三种不同进样体积时的色谱峰。在1ml进样体积时所显示的是一个峰的积分都没有显示出来的微弱色谱峰。在大进样体积的情况下，色谱峰有着较好的信噪比和信号强度，这使得这样方法能够分析低浓度样品（能达到pg级、亚 pg级）。为测试采用20ml定量环时多次注射器取样进样方法的重现性，我们采用了1pg/ml标准样品重复8次进样分析；实验结果如表1 所示意。本实验没有采用内标法，如果能选择一个合适的内标，相对百分标准偏差（RSD%）将可能进一步得到改善。表2所示1ml、5ml和20ml进样体积时各色谱峰的积分面积以及之间的差别。

除了定量分析方面数据外，每个目标分析物的定性分析方面的数据通过具备逆能量变化分析功能的QED串联质谱技术（QED-MS/MS）分析扫描获得。这种逆能量变化分析功能可以实现Q2中碰撞能量从高能量到低能量变化的同时，Q3对Q2产生的子离子从低质量端到高质量端到进行扫描分析。该方法所获得的丰富的子离子谱图信息，可以通过谱库检索或者离子强度计算的方法帮助排除“假阳性”实验结果。与固定碰撞能量下的Q3子离子扫描相比，逆能量变化扫描分析的方法能够提供更为丰富的子离子谱图信息。本实验中，逆能量变化扫描分析的碰撞能量设定为25eV以及其变化范围值设定为20eV。即Q2中碰撞能量从Q3的低质量端扫描时的45eV向Q3高质量端扫描时的25eV变化。图4 所示1pg/ml标准品的Q3全扫描中所获得的谱图，同时也显示了Q2中所采用的能量变化趋势。

表2. 样品浓度为1pg/ml、无内标实验重现性数据结果（n=8）。

小结

本实验采用一个预浓缩纯化样品的填充柱与一根分析高效液相色谱柱串联使用的方法定量分析饮用水样品中浓度范围为0.1~100pg/ml三嗪类除草剂混合物。该方法所采用的直接进样体积为20ml。EQuanTM环境分析系统所具有的大体积进样功能，省去样品离线浓缩处理过程，避免了工作量大且费用昂贵的固相萃取处理。该仪器系统所能提供的进样体积范围为1~20ml，可以根据实验所需要的灵敏度以及报告要求，为用户提供更大的选择空间。