细胞总乙酰化水平的快速测定方法

互联网 0 2021-01-11

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乙酰化快速测定 HRP

细胞总乙酰化水平的快速测定方法

　　步骤一：亲和色谱分离提纯乙酰化蛋白

　　1. 用细胞裂解液裂解细胞，10000rpm 离心2 分钟，取上清备用。

　　2. 取20-40ul 抗乙酰化赖氨酸抗体填料(Anti-acetylated lysine Agarose,ICP0388，如右图所示)，

　　用PBS 洗2 次，每次1ml。

　　3. 将细胞裂解上清液与洗好的填料(ICP0388)混匀，39oC 旋转摇床低速孵育60 分钟。

　　4. 1000rpm 离心1 分钟，去上清，用PBSt 重悬沉淀，1000rpm 离心1 分钟，去上清，重复3 次，

　　最后一次用PBS 洗，吸弃上清。

　　注：细胞裂解液里应该含有蛋白酶抑制剂，组蛋白乙酰化酶抑制剂等。

　　步骤二：释放及包被固定分离提纯的乙酰化蛋白

　　5. 用20ul 0.1M HCL 将步骤2 的抗赖氨酸抗体填料-乙酰化蛋白复合物于沸水中煮2 分钟，10000rpm

　　离心1 分钟，将上清液体全部转移到含有80ul 的0.2M Na2CO3 的ELISA 薄板上，39oC 孵育30 分钟;

　　6. 取出ELISA 薄板，拍干。用PBSt 清洗2 次，每次均需拍干。加入100ul 含0.5%BSA 的PBSt ，39oC

　　封闭10 分钟。

　　步骤三：用抗乙酰赖氨酸抗体HRP 标记物检测蛋白乙酰化水平

　　7. 取出ELISA 薄板，拍干，用PBSt 清洗2 次，拍干。加入100ul 浓度为0.25ug/ml 抗赖氨酸抗体

　　HRP 偶联复合物(Anti-acetylated lysine HRP conugates,ICP0381，如右图所示)，39oC 孵育30 分钟。

　　8. 取出ELISA 薄板，拍干，用PBSt 清洗板孔3 次，每次均需拍干。加入100ul TMB 液，39oC 孵育显色

　　10-20 分钟。最后加入100ul 0.1 M H2SO4 终止反应，在450nm 波长下读数。

内容来源：互联网

责任编辑：展源

审　　核：何发