1 引言
1963年Merrifield创建了固相多肽合成，用简单的洗涤操作代替了经典合成方式中的分离、重结晶、板层和柱层等纯化操作，其优越性使该方法广泛用于各种模式多肽和天然多肽的制备。但产物消旋是合成中普遍存在的现象，即原料氨基酸为L型(或D型)，而产物中某些氨基酸残基会转变为D型(或L型)[1]，从而影响终产品纯度与收率。因此，防止消旋化成为多肽合成中一个十分重要的问题，而消旋产物的检测与分析是其中的关键。
RPHPLC具有极高的分辨率，已广泛应用于多肽和蛋白的分离。由于多肽在疏水性固定相表面上的吸附与解吸不仅取决于氨基酸序列，而且与其空间结构有关，即“疏水脚”的细微差别将使构象不同的多肽具有不同的色谱保留行为[2]。因此，RPHPLC可有效分离序列几乎完全相同的多肽及多肽的消旋化产物[ 3～5]。
本研究对采用HBTU/Fmoc固相法[6]化学合成弱疏水性七肽(H2NPFNSLAICOOH)时出现的消旋产物进行了RPHPLC/MS 分析：基于适用于不同分离对象的塔板理论[7]、Onoff理论[8]和计量置换理论[9]等已有RPHPLC保留机理，根据弱疏水性多肽特性 ，提出“早期吸附”概念，并经色谱条件优化，得到了峰形良好的谱峰。通过将不同MSn条件下所得离子碎片和丰度信息进行选择性叠加[10]，实现了对每一多肽的一级测序，由此成功分析了合成七肽的4个消旋产物，为消旋化检测提供了一种新方法。
2 实验部分
2.1 仪器和试剂
高效液相色谱系统(大连依利特分析仪器有限公司),包括P200Ⅱ型高压恒流泵、UV200Ⅱ紫外可变波长检测器和Echrom98色谱工作站。色谱柱：Lichrosorb RP18, 粒径5 μm, 填料孔径10 nm, 200 mm×4.6 mm(美国惠普公司);Lichrospher 100 C18, 粒径5 μm, 填料孔径10 nm, 250 mm×4 mm(德国Merck公司);液/质联用仪：电喷雾离子阱质谱LCQ Advantage MAX，Bioworks 3.0数据处理软件(美国Thermo Finnigan公司)。七肽按文献[11]采用固相法手工合成;乙腈(色谱纯，德国Merck公司);三氟乙酸(TFA)(色谱纯，迪马公司);超纯水(自制)。
2.2 色谱条件
流动相：A液：水(0.1%TFA);B液：乙腈(0.1%TFA)。最优梯度洗脱模式：0→10 min，B液0→7%;10→14 min，B液7%→30%;14→48 min，B液30%→50%。柱温：室温;流速：0.7 mL/min;检测波长214 nm;样品用60%乙腈/水溶解，浓度5 g/L;进样量20 μL。
2.3 质谱分析
色谱条件同上。电喷雾电离(ESI)，正离子检测，碰撞气为氦气，雾化气(N2)流速5 μL/min，源温200℃，雾化压力0.345 MPa;扫描范围：50～2000 m/z。第一次质谱分析采用全扫描，以获得每个色谱峰准确且单一的m/z值，随后的质谱分析中改变相对碰撞能量等参数以获得一系列MS2图谱来完成多肽测序，采用Bioworks 3.0软件分析碎片信息，按文献[10]方法进行谱图的叠合解析。
3 结果与讨论
3.1 合成七肽粗品的质谱直接进样分析
对合成七肽粗品用质谱注射泵直接进样进行全扫描分析，得到单一的m/z 761.5 [M+H]+ 峰，与目标多肽分子量760.9吻合，说明合成产物纯度很高，并未生成大量断头肽和空心肽之类的杂质。
3.2 合成七肽粗品的RPHPLC分析
3.2.1 弱疏水性多肽RPHPLC保留行为解析 RPHPLC中溶质保留机理的预测一直是色谱理论研究的热点，迄今为止提出的模型多达10余种，应用较多的主要有：适用于小分子物质的塔板理论[7]、 Snyder经验公式、溶解度参数模型、溶剂色效模型、疏溶剂化模型等[8];而对于生物大分子而言，Onoff模型[9]、尤其是耿信笃提出的计量置换保留理论(SDTR)是目前公认的保留机理[8]。
基于吸附机制提出的Onoff模型认为：在多肽及蛋白质的RPHPLC分析中，初始洗脱条件下有机改性剂浓度较低，溶质分子与固定相之间的疏水作用较强，几乎完全吸附，“停滞”不动。而一旦洗脱液中有机改性剂(或称为强溶剂、置换剂等)达到临界浓度，使得多肽或蛋白质与流动相间的作用大于其与固定相的作用，则溶质“瞬时”解吸到流动相，并形成尖锐的洗脱峰，此后溶质与固定相无任何作用。这一理论对于疏水性很强的蛋白质和多肽等大分子物质是适用的。
对于实验中合成的弱疏水性七肽(亲疏水性值按文献[12]方法计算为-6.1)，本研究提出可将色谱柱前后分为吸附段a和分配段b两段，并认为溶质的色谱保留行为是吸附和分配两种机理的综合。初始洗脱条件下有机改性剂浓度较低，溶质被完全吸附于a段，为吸附机制控制;当洗脱液中有机改性剂达到临界浓度，多肽被瞬时洗脱后，并非像“Onoff”理论所述溶质与固定相之间再无任何关系，而是在b段仍有一定作用，为分配机制所控制。为了增大分配机制在 b段的贡献，可引入“早期吸附”过程，即将初始洗脱液中有机改性剂浓度设为极低值，并保持一段时间(约10 min)。此时，由于流动相溶剂与被分离多肽之间的作用力远远小于固定相与多肽之间的作用力，则样品在初期即可快速而完全地吸附于固定相上。因此前段的吸附段a明显缩短;又由于每根色谱柱柱长一定，a段缩短相对延长了后段分配段b的长度，因此，可实现增大b段中分配机制贡献的目的。如图1所示，当引入“早期吸附”后，分离度得到改善;反之，当舍弃“早期吸附”时，则溶质未能充分吸附即被快速洗脱，所以出峰较早、分离度较差(图2)。
图1 引入“早期吸附”合成七肽的色谱图(略)
Fig.1 Chromatogram of heptapeptide with preadsorption
B%为流动相中B液的体积分数(B% is the volume fraction of solution B in mobile phase)。
在相同洗脱条件下，使用3支不同塔板数的C18色谱柱分析该七肽。如果按Onoff理论所述单纯由吸附控制，则分离度与塔板数无关，应得到相同的谱图。但实验结果却发现，分离度有一定差异(图3)，说明b段的分配机制对分离效果确有影响。综合考虑a、b两段，可以证明：弱疏水性小肽的RPHPLC保留行为不同于疏水性蛋白，是分配和吸附双重机制共同作用的结果。
图2 舍弃“早期吸附”的合成七肽色谱图(略)
Fig.2 Chromatogram of heptapeptide without preadsorption
B%为流动相中B液的体积分数(B% is the volume fraction of solution B in mobile phase)。
图3 3支不同塔板数的C18色谱柱分析(略)
Fig.3 Analysis using three C18 chromatographic columns with different plate numbers
1. Lichrosorb RP18(10 μm, 10 nm, 200 mm×4.6 mm) 塔板数(plate numbers)=6000; 2. Lichrosorb RP18(5 μm, 10 nm, 200 mm×4.6 mm) 塔板数(plate numbers)=12000; 3. Lichrospher100 C18(5 μm, 10 nm, 250 mm×4 mm) 塔板数 (plate numbers)=15000。
3.2.2 RPHPLC分析条件优化 首先用纯乙腈和纯水组成的梯度洗脱体系分析合成七肽粗品(图4A)，峰1(图中标识)未得到理想分离;随后不断降低梯度斜率，以使峰1与其它谱峰分开，得到一系列色谱图(图4B、4C、4D)。由图可知：随着梯度斜率的缓慢降低，分离度得到改善，但峰形逐渐变钝，并发生托尾。这说明疏水性蛋白和多肽对有机改性剂的变化较为敏感[13];相反弱疏水性小肽(即本文所合成七肽的消旋产物，对应于图4中各谱峰)则反应“迟钝”。即将后者从固定相上洗脱所需溶剂突越范围较宽[14]，改变梯度斜率对其影响相对较小。所以，当梯度斜率降至一定程度时，只有改变其它色谱条件方能得到理想峰形。
图4 不同梯度条件下的合成七肽(弱疏水性肽)色谱图(略)
Fig.4 Chromatograms of heptapeptides (i.e. weak hydrophobic peptides) at different gradient elution conditions
B%为流动相中B液的体积分数(lichrospher100 C18, 5 μm, 10 nm, 250 mm×4 mm; B% is the volume fraction of solution B in mobile phase)。
在流动相中加入0.1%的TFA，如图5所示(洗脱模式见2.2)，分离效果理想，共得到4个谱峰。根据3.1质谱直接进样分析结果，初步证明4个谱峰对应于七肽的4个消旋产物。
3.3 液质联用对合成七肽消旋产物的测序分析
首先采用LC/ESI/MS对图5中的4个谱峰进行全扫描，发现4个谱峰的m/z均为761.5;随后进行第二次实验，使用LC/ESI /MS2对每一谱峰进行在线多肽测序，通过改变相对碰撞能量60、38和25 eV，得到丰富的碎片信息。结果表明：4种产物的分子量和序列完全一样，是合成七肽的4个消旋产物，由排列组合分析可以推断是肽链上的两个氨基酸残基发生了消旋[15]。
在进行MS2测序时，很难在同一质谱条件下得到全部碎片信息。不同条件下得到的图谱在碎片离子峰的多少和信号强弱的分布区域等方面具有一定的互补性，可以有选择地将谱图叠合起来进行分析，从而达到简化串联质谱解析和提高多肽测序准确性的目的[10]。图6为二级质谱分析中合成七肽的b轴和y轴片段信息，由此确定了合成七肽的4个消旋产物。
图5 合成七肽最优色谱图(略)
Fig.5 Optimized chromatogram of heptapeptide
图6 谱图叠加后的合成七肽MS2分析(略)
Fig.6 MS2 analysis of heptapeptide by spectrum superposition
A.合成七肽b轴与y轴断裂碎片示意图(b and y fragment ions of synthsized heptapepetide); B. 合成七肽MS2谱图(MS2 spectrum of synthesized heptapepetide)。
3.4 小结
本研究对采用HBTU/Fmoc固相法化学合成弱疏水性七肽(H2NPFNSLAICOOH)时出现的消旋现象进行了RPHPLC/MS分析：(1)讨论了弱疏水性七肽在RPHPLC中保留机理的特殊性，基于塔板理论、onoff理论和计量置换理论提出了“早期吸附”概念，以此优化色谱条件可充分利用分配和吸附双重保留机制来改善分离效果，并最终得到4个峰形良好的色谱峰;(2)质谱直接进样分析表明：4谱峰具有相同的m/z 761.5 [M+H]+ 值，与目标多肽分子量760.9吻合，对应于合成七肽的4种消旋产物;(3)对每一谱峰进行在线多肽测序，将不同MS2条件下的离子碎片和丰度信息进行选择性叠加，得到b轴和y轴的碎片信息，成功地分析了合成七肽的4个消旋产物。
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本文系国家自然科学基金资助项目(No.20306023)
(天津大学化工学院化学工程研究所，天津 300072)
(天津天士力集团，天津 300402)
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