基因载体是基因工程的核心，也是基因治疗中强有力的生物工具，我们先来认识和阅读载体图谱吧。

　　载体分类及载体组成元件

　　载体分类

　　1、按属性分类：病毒载体和非病毒载体

　　病毒载体是一种常见的分子生物学工具，可将遗传物质带入细胞，原理是利用病毒具有传送其基因组进入目的细胞，进行感染的分子机制。可发生于完整活体或是细胞培养中。可应用于基础研究、基因疗法或疫苗。用于基因治疗和疫苗的病毒载体应具备以下基本条件：

　　(1)携带外源基因并能包装成病毒颗粒;

　　(2)介导外源基因的转移和表达;

　　(3)对人体不致病;

　　(4)在环境中不会引起增殖和传播。

　　非病毒载体一般是指质粒DNA。

　　2、按进入受体细胞的类型分类：原核载体、真核载体、穿梭载体(含原核和真核2个复制子，能在原核和真核细胞中复制，并可以在真核细胞中有效表达)。

　　3、按功能分类：克隆载体、表达载体

　　克隆载体：具有克隆载体的基本元件(Ori，Ampr，MCS等)，可以携带DNA片段或外源基因进入受体细胞并克隆和大量扩增DNA片段(外源基因)的载体。

　　表达载体：克隆载体中加入一些与表达调控(具有转录/翻译所必需的DNA顺序)有关的元件即成为表达载体。

　　载体组成元件

　　1、复制起始位点Ori：即控制复制起始的位点。Ori的箭头指复制方向，其他元件标注的箭头多指转录方向(正向)。

　　2、抗生素抗性基因：可以便于加以检测，如Amp+ ，Kan+

　　(1)Ampr：水解β-内酰胺环，解除氨苄的毒性。

　　(2)tetr ：可以阻止四环素进入细胞。

　　(3)camr：生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。

　　(4)neor(kanr)：氨基糖苷磷酸转移酶，使G418(卡那霉素衍生物)失活。

　　(5)hygr：使潮霉素β失活。

　　3、多克隆位点：MCS克隆携带外源基因片段，它具有多个限制酶的单一切点，便于外源基因的插入。如果在这些位点外有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，便于筛选。决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。还要再看外源DNA插入片段大小。质粒一般只能容纳小于10kb的外源DNA片段。一般来说，外源DNA片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。

　　4、P/E：启动子/增强子

　　5、Terms：终止信号

　　6、加poly(A)信号：可以起到稳定mRNA作用

　　示例阅读载体：

　　1.pENTER载体

　　1)human ORF + pENTER载体

　　2) CMV启动子，T7启动子

　　3) ORF的C端融合了Flag和His tag

　　4) 多克隆位点，常用AsisI 和 MluI(人源基因上不常见的)

　　4) SV40 poly(A)加尾信号

　　5) SV40启动子启动的puro标记

　　6) 2个腺病毒ITR序列和2个与腺病毒Ad5同源的序列，可用于将ORF序列同源重组到腺病毒载体，直接用于腺病毒的生产。

　　2.慢病毒载体

　　1)EF1a启动目的基因(可添加小标签FLAG或HIS等小标签)

　　2)CMV启动GFP，非融合抗性筛选标记Puro(便于做细胞株的稳筛)

　　3)WPRE(来自土拨鼠肝炎病毒的转录后调节元件)，放置在目的基因的上游，能加强转基因的表达

　　4) cPPT(来自HIV-1整合酶基因)，增加慢病毒在宿主基因组的拷贝数，提高病毒滴度

　　5)第三代慢病毒载体，载体中还包含HIV-1基因组中的顺式调节元件(ψ 包装 信号和LTR 长末端重复序列，其中3’LTR增强子功能缺失，5’LTR中U3区替代为CMV，更加安全的病毒载体)

　　3.腺相关病毒载体

　　AAV表达载体包括了中两个ITR + CMV(可替换其他组织特异性启动子，见改造载体部分)+ globin intron 内含子序列 + 目的基因 + poly A序列

　　选择载体

　　选择载体主要依据构建的目的，同时还要考虑载体中应有合适的限制酶切位点等。如果构建的目的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。选用哪种载体，还是要结合目的基因及载体特点以实验目的为准绳。

　　载体选择主要考虑下述3点：

　　1、构建DNA重组体的目的，克隆扩增/表达表达，选择合适的克隆载体/表达载体。

　　2、载体的类型：

　　(1)克隆载体的克隆能力—据克隆片段大小(大选大，小选小)。尤其对于病毒载体来说，载体包装容量的大小是评估能否成功包装病毒的首要因素。

　　①腺病毒可以插入长约8kb的外源基因。目前，我们包装过长度为7.5kb外源基因的腺病毒。

　　②慢病毒的包装容量约为6kb(包含载体带有的其他抗性基因或报告基因)，但是2kb以上的外源基因包装慢病毒难度就增加了，增大1kb会下降1个单位数量级的滴度，故2kb以上的基因包装慢病毒需要进行评估。此外，毒性蛋白、凋亡蛋白和膜蛋白(作为受体、转运蛋白行使功能)等由于其本身的功能，包装可能会有一定难度。

　　③AAV的总包装容量是4.7 kb(包含载体中两个ITR约0.3kb +具体启动子 + 内含子约0.6kb + 具体荧光标签 + polyA约0.2kb)，所以插入目的基因一般约2kb 左右。由于AAV包装容量有限，目的基因大于2kb，可考虑去除内含子，因为内含子只是有助于插入的目的基因稳定表达。

　　(2)确定表达蛋白的目的，然后再来选择优势的表达质粒。一般分为原核表达和真核表达质粒，前者主要用于体外纯化蛋白，如带His-tag的PET系列，带GST-Tag的PGEX系列，选用不同的表达载体，就得建立相应的纯化系统，包括缓冲液的配置、珠子/柱子的选择等等，还得考虑目的蛋白的可溶性，一般大tag的融合蛋白可溶性要好一些，如GST的。这种原核纯化的蛋白一般用来制备单一的、需要量大的蛋白。真核表达载体一般是细胞、体内表达等需要时所用，只需要将它放到细胞或体内细胞即可，唯一考虑的是它的启动子的选择，常用都是cmv启动子的，表达效率较高，也有多种启动子经过改造的表达载体，一般用来表达需要调控表达时间及表达量的蛋白。

　　3、载体MCS中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于连接，不产生阅读框架错位。

　　①选分子量小的质粒，即小载体(1-1.5kb)→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多(也有大载体);

　　②一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般10个以上的拷贝，而严谨型质粒<10个;

　　③必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地;

　　④必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因。

　　选择载体还需注意：

　　无标签载体，起始/终止密码子都要添加!

　　标签在N端的载体，终止密码子要添加!

　　标签在C端的载体，起始密码子要添加!