利用改进了的蒸发方法验证硝基呋喃的残留

硝基呋喃类抗生素具有潜在的致癌作用，因此欧盟规定，在食品生产过程中需对硝基呋喃进行严格的检验控制。而合适的样本制备方法则能帮助提高检测分析的效率和准确度。

由于硝基呋喃残留物可能有致癌作用，从1995年起欧盟开始命令禁止使用硝基呋喃类抗生素。2002~2003年欧盟建立了严格的监控管理制度，通过高灵敏度的检测方法对食品(主要是肉、鱼、贝类)中的抗生素类进行严格检验。欧盟规定最低执法限量为可食组织1µg/kg,这一执法限量不仅适用于欧盟本地生产的食物也同样适用于进口食物。

关于这类药品代谢物和衍生物的检测、识别方法有很多。但为避免基质效应，对样本制备的方法要求比较高，制备过程中的蒸发是一件费时费力、工作密集型的工作。本文将向您介绍：苏黎世Kantonalen实验室(KLZH)所研发的优化样本制备的方法。

图1：硝基呋喃样本的制备和分析方法。

硝基呋喃检验分析样本的制备

许多文献所介绍的样本制备方法是基于色谱分离技术或质谱分离技术(MS)的物理-化学分析的样本制备方法。而苏黎世Kantonalen实验室的常规方法(见图1)如下：

组织样本的均质化;酸水解，释放组织结合的代谢物;在代谢物的衍生物中加入邻硝基苯甲醛，提高分子量和检测灵敏度;利用乙酸乙酯进行液-液萃取;蒸发至干燥;用水再悬浮;清洁样本，利用固相萃取(SPE)清除干扰性的矩阵元素，例如去脂;利用含氨的甲醇进行洗提;蒸发至干燥;用规定的、适合于色谱分析的较低溶剂量进行再悬浮;利用超高效液相色谱(UHPLC)和MS / MS进行分离。

样本制备过程中，萃取和两次蒸发干燥过程是非常耗时的劳动密集型的工作。

在苏黎世Kantonalen实验室中，蒸发是利用传统的旋转式蒸发器进行的;在硝基呋喃检测中，这种制备方法被证明是有着高提取率的可靠方法，但此法被证明也有一些不足。

由于旋转式蒸发器是一种‘单一的’的样本制备设备，这就需要对蒸发过程进行不间断的监控，避免出现“泡沫”或“沸腾延迟”等现象。

在苏黎世的实验室中，硝基呋喃的一个检验批次的样本通常是5~30个。当制备样本的数量较少时，可以用旋转式蒸发器来完成样本制备。

蒸发技术的革命

为提高蒸发效率，开发了以下三种原则上属于‘批处理’的蒸发方法：

图2：吹气蒸发(A)、涡流蒸发(B)和真空离心蒸发(C)三种蒸发方法原则上都适合于大批量的样本制备。

吹气蒸发

这种方法是利用针头般的细管把气体(如氮气)吹入样本容器中，在液体样本表面产生一定的气体流动，改变气相与液相之间的平衡。样本的温度随着加热的温度升高而升高，利用加热来提高蒸发效率。

但对于易挥发的液体介质来说，这种蒸发方式样本提取率不高，但冷吹蒸发是一种相对较快的蒸发方法。针对沸点高的液体或像水一样不易蒸发的液体，冷吹蒸发的过程会明显变长。同时，也要求操作者要时刻监视蒸发过程，判断是否到干燥结束的时候了，或观察针头细管距液体表面的距离是否最佳。

涡流蒸发

在这一蒸发方案中，样本将在真空环境中被加热，保证了样本在蒸发过程中是‘冷的’;并且对样本施加一定的振动力，以便液体样本内出现涡流。涡流使得液体介质的表面积增大，从而加速液体蒸发。但这也把干燥的物质分布到较大的面积上，粘附在容器壁上，增加了收集的难度。由于要避免沸点延迟和发泡的涡流运动，导致和离心蒸发不同的是，其所需的重力加速度g并不高，系统的控制装置能够在蒸发过程中自动调整涡流运动所需的能量。但涡流蒸发通常会造成样本污染和或损失。

真空离心蒸发

真空离心蒸发是在真空状态下使液体中的水分被蒸发，因此样本保持着‘冷态’。这一系统是使用冷阱来回收溶剂蒸气的。在离心力的作用下，液体表面下凹。这种蒸发有效的避免了煮沸溢出、起泡沫和沸腾延迟等现象，也避免了样本的损耗或交叉污染。

溶剂施加在液体表面的压力与环境系统保持一致，压力是由该材料的质量乘以转子产生的g力而形成的。离心蒸发技术适用于蒸发多种不同液体样本时使用。样本可以在真空离心蒸发过程中被浓缩，直至干燥成膜;或被冻干。控制系统可以自动化完成蒸发过程，而且系统有干燥终点识别功能。

蒸发系统的评判结果

以硝基呋喃的分析为例子，对上述三种蒸发系统在样本制备中的性能进行了分析评判。主要从样本污染、蒸发时间长短和沸点延迟、溶剂回收和使用的必要性、经常性等方面进行评判。评判的结果见表1。

表1：溶剂蒸发设备的评判分析结果

降低了交叉污染的风险，节约了时间

在处理一批次20件样本时，利用旋转式蒸发器第一次蒸发干燥需要大约1.5h，第二次还需2.5h~3h。在完成20个样本制备时，总共需要大约4h~4.5h的操作和监控时间，其中也包括了更换样本的时间。

在利用真空离心蒸发时，样本制备的两次蒸发干燥用时共计3h。而且在这一段时间内真空离心蒸发设备是自动运行的，无需专人监控，操作者可以在此期间去做其他未完成的工作。

此系统一次可以制备48份硝基呋喃测试样本。虽然样本数量较多，但制备时间只比20份样本所用时间多出1h。与旋转式蒸发器相比较可以缩短大约2h~3h的时间。

在苏黎世KLHZ实验室安装使用了EZ-2 Envi型(英国Genevac公司)蒸发器后可以比原来在硝基呋喃样本制备过程中节约2小时到3小时的时间。这一设备允许在一个工作日内处理大量的检测样本。它降低了交叉污染的风险。过去经常出现的假阳性诊断分析结果是一个样本或者整批样本重新分析(多重分析)主要原因。但现在EZ-2 Envi的全自动控制就完全避免了这种可能性。

图3.Ex-2 Envi 蒸发器。

提高样本制备的能力

在食品的硝基呋喃样本制备过程中，要提取样本并进行两次蒸发干燥。这一过程是一个耗费时间和劳动密集型的工作过程。真空离心蒸发技术能够帮助您节约大量的时间。它不仅能够处理大量的样本，同时也降低了交叉污染的风险。另外，这一检测分析设备还是一种全自动的、可以无人值守的检测分析设备。