【柱后光化学衍生HPLC荧光法测定黄曲霉毒素】

本文主要研究食品基质(谷物，芝麻酱等)中四种黄曲霉毒的测定方法。样品经过免疫亲和小柱净化，采用柱后光化学衍生方法和荧光检测进行测定，并对检出限、定量限、重现性、回收率等方面进行了方法学考察。此法可以满足法规上关于定量限的要求，比起常用的柱后电化学衍生方法更加容易操作。

黄曲霉毒素是一种由真菌产生的有毒的致癌物质。在适当的温度湿度条件下，它可以在土壤、谷物、坚果或腐烂的植物中生长。自然界中自然产生的黄曲霉毒素有14种之多，其中毒性最大的是黄曲霉毒素B1。因此，很多国家的相关法规都对食物中黄曲霉毒素B1的含量做了严格规定，通常，对毒性比B1略小的其他三种黄曲霉毒素B2、G1和G2的含量也做出相应规定。例如欧盟规定黄曲霉毒素B1在食物(如谷物，坚果)中的含量最大允许范围在2.0~8.0ppb，上述四种黄曲霉毒素总含量允许值范围在4.0到15.0ppb。美国FDA规定食品含量限定值为20ppb，饲料含量限值为300 ppb。中国GBT18979-2003规定四种黄曲霉毒素总量检出限应为1ppb。

黄曲霉毒素测定通常使用液相色谱-荧光检测的方法完成。由于有些黄曲霉毒素在含水流动相中会发生荧光淬灭，故需采取衍生技术将它们衍生为不会淬灭的型态。目前应用普遍的衍生方法是在溴的作用下进行柱后电化学衍生。此法有很好的灵敏度，但也有很多缺点：要使用到对仪器有强烈腐蚀作用的含溴流动相;衍生装置需要定期维护。

另一种衍生方法是利用紫外光使黄曲霉毒素与水进行衍生反应，水是反相色谱中的常用溶剂，所以此法操作十分简便，在灵敏度上与电化学衍生方法也有可比性。如图1

图1.黄曲霉毒素B1在紫外线作用下与水发生反应的示意图

实验部分

仪器条件

安捷伦1260 Infinity 液相色谱系统:

Agilent 1260 Infinity 四元泵 (G1311B);Agilent 1260 Infinity 标准自动进样器 (G1329B);

Agilent 1260 Infinity 柱温箱(G1316A);Agilent 1260 Infinity 荧光检测器 (G1312B), 配置标准检测池(8 µl);柱后光化学衍生装置(串联于色谱柱出口与荧光检测器入口之间)。

色谱条件

色谱柱:Agilent Poroshell 120EC-C18, 3.0 x 50 mm, 2.7µm (p/n 699975-302);免疫亲和小柱 (RIDA®Aflatoxin column) 流动相:水/甲醇(65:35，v:v);停止时间:13.5 min;流速:0.4ml/min;进样量:10 μl;柱温:30℃;检测器参数:Ex：365 nm,Em：440 nm;采样频率：1.16 Hz,增益:10。

色谱柱

Agilent Poroshell 120 EC-C18, 3.0 x 50 mm, 2.7 µm (p/n 699975-302)，软件(二级标题)

OpenLAB CDS ChemStation Edition for LC & LC MS Systems, Rev.C.01.03

试剂

溶剂：甲醇(HPLC级)，超纯水MilliQ超纯水制备系统制备。

标准品：黄曲霉毒素标准品 (99%+ B1: 1.055 µg/mL, B2: 0.327 µg/mL, G1: 1.082 µg/mL and G2: 0.309 µg/mL 溶解于甲苯/乙腈 (98:2))。

样品和标准品制备

玉米粉样品购买于本地超市。加标玉米粉样品:样品前处理前向上述玉米粉样品中加入浓度级别4的标准品(浓度数值见表1)。标准添加玉米粉样品：含有9.00ppb B1和0.6ppb B2;芝麻酱样品：含有4.57ppb B1，其他三种浓度未知;酸枣仁样品(2010版中国药典规定进行黄曲霉毒素检测)。

标准溶液配制：取10ul标准品溶液置于10ml容量瓶中，室温下氮气吹干，用甲醇-水溶液(50:50, v:v)复溶，之后稀释成如下浓度作为标准曲线不同浓度点。

表1.浓度级别

样品处理：取5g样品(见表2)和0.5g氯化钠置于50ml离心管中，加入25mL甲醇-水溶液(70:30, v:v)，高速匀浆1min，以转速5000离心5min，取5ml上清液，加入15ml水，转移全部的20ml溶液经免疫亲和小柱净化。

表2.5种样品

免疫亲和小柱净化过程：用2ml超纯水活化小柱;将要净化的样品加入到小柱上，控制流速在1滴/s，使样品溶液流过小柱;用10ml超纯水清洗小柱，弃去洗脱液;用注射器打气排空小柱大概10s以排干小柱内的残留液体;使用0.5ml甲醇以1滴/s的速度洗脱小柱，确保洗脱全部黄曲霉毒素;用注射器打气排空小柱收集全部洗脱液;向洗脱液中加入0.5ml超纯水，涡旋混匀;用0.22μm滤膜过滤。

结果和讨论

使用上述方法对四种黄曲霉毒素标准品(第4级浓度，蓝色)进行了分析并与空白进样(红色)进行了比较，结果见图2，根据色谱图可以看到四种黄曲霉毒素可以在13.5min内达到良好的基线分离。图中可以看到色谱峰有较大展宽，这主要是由于样品经过光衍生装置中的衍生管造成的，为了保证足够的反应时间，流速较小，导致了样品峰在管线中的扩散。

图2.空白进样 (红色) 和黄曲霉毒素标准品色谱图(蓝色)

峰面积和保留时间重现性

对标准品(浓度级别4)进行了6次重复的分析考察峰面积及保留时间的重现性，结果显示保留时间RSD%均小于0.15%，峰面积RSD%均为0，峰面积重现性良好也表明衍生效果稳定，定量结果可靠。具体结果见表3 。

表3.保留时间和峰面积重现性 (n = 6)

检出限(LOD)和定量限(LOQ)

用浓度级别1与浓度级别2的标准品分别进样分析以考察检出限(LOD)和定量限(LOQ)(图3a和3b)，结果按照信噪比进行折算，LOD取S/N=3的浓度，LOQ取S/N=10的浓度，结果见表4。结果显示，此方法的检出限与定量限可以完全满足国标GBT 18979-2003的要求。

图3.(上)检出限(LOD)和(下)定量限(LOQ)。

表 4: 检出限(LOD)和定量限(LOQ)

线性

五个不同浓度的标准品(浓度级别2～6)进样分析以考察线性，4种黄曲霉毒素的线性相关因子R均>0.999，结果见表5。

图4.5个不同浓度标准品色谱图重叠 (浓度级别2～6)

表5.4种黄曲霉毒素的线性相关因子

样品分析

回收率：分别把标准品和加标样品按照相同前处理步骤和测定方法进行，以考察前处理和方法回收率，结果见6，标准品和加标样品测得的回收率值一致性好，证明基质不会影响回收率，回收率数值在55～75%之间，比免疫亲和小柱说明书中报告的值(70～110%)略低。

表6.标准品和加标样品回收率

将标准品加入玉米粉当中，按照上述前处理步骤处理。结果显示，未加标的玉米粉样品中不含有黄曲霉毒素，在加标样品中，我们可以看到目标组分与基质干扰峰有良好的分离。加标玉米粉样品(红色)和标准添加玉米粉样品(蓝色)色谱图比较见图6.(标准添加玉米粉样品：含有9.00ppbB1和0.6ppb B2)。含有四种黄曲霉毒素的芝麻酱样品色谱峰分离色谱图见图7。

图5.玉米粉样品(红色)和加标玉米粉样品(蓝色)色谱图的比较。

图6.加标玉米粉样品(红色) 和标准加入玉米粉样品 (蓝色)。

图7.含有四种黄曲霉毒素的芝麻酱样品色谱峰分离色谱图。

酸枣仁是一种常见中药，有镇静安神，镇痛，降低血压等作用，收载于中国药典2010版一部当中，在“检查”项中要求对黄曲霉毒素进行测定。图8为酸枣仁样品(蓝色)和标准品(红色)的色谱图，可以看出，被分析的酸枣仁样品当中不含有黄曲霉毒素。

图 8.酸枣仁样品 (蓝色) 和黄曲霉毒素标准品 (红色)。

不同样品的定量测定结果见表7。

表7.5种样品的定量结果

图 8.酸枣仁样品 (蓝色) 和黄曲霉毒素标准品 (红色)。

考虑到回收率的影响，这些结果与确定含量样品的真实含量相吻合，表明此方法定量结果可靠。

小结

本文介绍了简单的柱后光衍生设备及荧光检测同时测定食品基质中黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2的方法。其线性及重现性良好，可将被测成分与基质干扰峰分离。比起电化学柱后衍生方法，所需设备简单，且避免了使用腐蚀仪器的流动相。虽然光化学衍生的方法比电化学衍生法的灵敏度略低，但是在检出限和定量限上完全可以满足现行法规的要求，