鉴于生物毒素的高毒性和高致癌性，在分析过程中希望尽量避免操作人员的暴露时间。同时，为了提高分析效率，降低分析费用，提高分析的重现性，实现生物毒素分析的自动化是十分必要的。

生物毒素的分析通常包括提取、净化、分析三个步骤。提取步骤一般采用溶剂震荡提或者索氏提取的方法，此类方法较难自动化实现。最近亦有人采用压力溶剂萃取(ASE)对黄曲霉毒素进行提取研究。将硅藻土与磨碎的样品混合在一起，以甲醇: 乙腈(1:1)为萃取溶剂，在80℃的条件下萃取5min，循环萃取两次，萃取结束后用氮气将萃取罐内的溶剂吹出。整个萃取过程耗时12min(研磨和萃取柱填装时间不计)。后续采用免疫亲和萃取，液相色谱光化学催化荧光检测的方法进行分析，得到了良好的回收效果。

在线免疫亲和净化

采用免疫亲和固相萃取的方法进行生物毒素的净化是一种有效的前处理方法。此方法是利用抗体抗原的特异性反应，选择性吸附生物毒素，去除干扰杂质。与传统的净化技术相比，免疫亲和固相萃取具有以下特点：净化效率更高;线性范围更宽;减少有害溶剂的使用;简化净化步骤降低整体分析时间。但是固相萃取操作多数情况下需要人工操作，由于个人操作习惯以及实验室之间使用设备的不同，可能降低分析重现性以及不同实验室间的重现性。同时，大量的操作人员暴露时间也增加了对操作人员造成伤害的可能性。为解决这些问题，人们正在寻找一种方法，将免疫亲和固相萃取技术和高效液相色谱柱后衍生荧光检测技术进行联机，以完全自动化地实现黄曲霉毒素的分析。

表1. 采用第一类全自动分析系统的数据统计

目前报道的这类全自动联机黄曲霉毒素分析系统可以分为两类，一类是在自动固相萃取系统上配备进样阀作为液相色谱系统的进样系统，另一类是将一个可以反复使用的免疫亲和固相萃取柱连接到液相色谱的进样系统上，自动实现萃取和进样操作。

第一类全自动分析方法实质上是将传统的手工操作实现了自动化，所以采用此类系统可以方便地将手工操作方法进行移植。同时，由于使用了全自动化的设备，减少了人为的操作，故可以有效提高分析效率，提高分析结果的重现性，并能保护操作人员。D.Chan 等人采用一个开放的全自动固相萃取平台通过进样阀与液相色谱系统联机对7 种基质中的黄曲霉毒素(B1、B2、G1、G2)以及赭曲霉素A 进行分析，得到了良好的效果。

图1. 在线免疫亲和净化柱连接示意图。

Gerstel 公司采用其全自动固相萃取平台与LC/MS 系统联机对黄曲霉毒素(B1、B2、G1、G2)进行全自动分析。全自动固相萃取采用3 ml 免疫亲和柱对样品进行自动净化，并在净化后进行自动的柱后衍生以适应后续的质谱分析。此系统对四种黄曲霉毒素的检出限达到0.01 μg/kg。对黄曲霉毒素G1 和B1进行12 次分析的RSD 分别为3.4% 和5.3%，回收率分别为89.5% 和90.3%。同时，采用此全自动系统减少了操作人员50% 的暴露时间，有效保护了操作人员的安全。

第二类全自动分析系统的核心是可以反复使用的稳定免疫亲和固相萃取柱。因为此固相萃取柱有时会被切入高压系统，故其还要能够承受在较高压力下工作。

赵孔祥等用自制的在线免疫亲和柱搭建了一套在线免疫亲和净化- 液相色谱- 串联质谱系统，用来测定中药及中成药中的多种真菌毒素，其基本结构如图1 所示。

在线免疫亲和净化技术通过柱切换技术将在线净化柱与分析柱串联，目标化合物直接由净化柱洗脱至分析柱，实现了净化自动化。在线净化分析主要包括4 步：上样、转移、分析测定和清洗平衡，其中分析测定与在线净化柱清洗平衡可以同时进行。在转移过程中，在线净化柱与分析柱串联使用，其他步骤中两柱并联使用。他们运用此系统对10种真菌毒素的定量限为1~5 μg/kg，回收率为62.3%~107.1%，相对标准偏差为2.1%~15%，基本满足分析要求。遗憾的是此自制的免疫亲和净化柱对黄曲霉毒素吸附能力不足，未能实现对黄曲霉毒素的在线净化。

图2. 在线免疫亲和固相萃取- 液相色谱连接图集运行过程。

S.Jinap 采用一个商业化的可重复使用的免疫亲和固相萃取柱(Venture AFIAC, Grace)构建了一套在线免疫亲和净化- 液相色谱系统, 来测定食品中的黄曲霉毒素，见图2。系统由一个梯度泵(用于输送洗脱液和流动相)，一个等度泵(用于输送活化液)，一个自动进样器，两个自动六通阀，一个荧光检测器组成。Venture AF 在线免疫亲和净化柱内装以打孔硅胶为机体的免疫亲和填料，此填料可以在0~3000 psi 条件下长期工作，可以连续使用多达200 次以上而性能不发生变化。

应用此系统对黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2 进行分析，色谱峰型较好，线性范围较宽，线相关系数(R2)在0.999以上。其最小检出限(LODs)分别可以达到0.32、0.16、0.20、0.14 ng/ g，最小定量限可以达到0.64、0.32、0.40、0.29 ng/ g。对于食品样品进行加标实验得到黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2 的回收率分别为75.7%~92.9%，7 2 . 1%~1 0 3 . 0%， 7 6 . 0%~1 0 7 . 9%，82.1%~103.3%。同时，还对此系统的日内和日间重现性进行了考察，完全符合相关标准对黄曲霉毒素分析的要求。

小结

从目前的文献报道来看，很少有报道将提取、净化以及分析实现联机的系统。在当前的研究基础上，如果能够构建一种集萃取、净化、分析于一体的全自动分析系统，对解决提高生物毒素分析效率，提高重现性，保护分析人员，降低测试成本将具有重要的意义。从上面的分析可见，最合理的方式是将压力溶剂萃取(ASE)与在线免疫亲和净化-高效液相色谱进行联机使用，通过系统的综合控制，实现对固体样品的一体化全自动分析。