免疫亲和-衍生-LC测Aflatoxin

本网编辑 0 2020-05-27

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黄曲霉毒素是黄曲霉和寄生曲霉的代谢产物,广泛存在于自然界中.

黄曲霉毒素是黄曲霉和寄生曲霉的代谢产物，广泛存在于自然界中。最常见的黄曲霉毒素有B1、B2、G1、G2等，其中B1毒性最强，G1次之，B2、G2较弱。由于黄曲霉毒素的强毒性和强致癌性，许多国家和组织机构均规定了食品中的黄曲霉毒素的限量值。其中，欧盟规定了坚果、玉米、果脯等农作物中黄曲霉毒素B1的含量不得超过2.0~8.0μg/kg，B1、B2、G1和G2的总量不得高于4.0~15.0μg/kg。美国FDA分别规定了食物和动物饲料中的4种黄曲霉毒素的总量不得超过20μg/kg和300μg/kg。因此，建立准确、有效的黄曲霉毒素的测定方法非常重要。

由于农作物和食品中的黄曲霉毒素含量都比较低，样品基质非常复杂，免疫亲和柱净化结合柱前（后）衍生、HPLC-FLD检测的方法越来越多地应用于各种样品的分析。本文综合考虑色谱峰柱后扩散、分析速度、分离度及灵敏度，建立了免疫亲和柱净化-柱后电化学（Br2）衍生快速测定黄曲霉毒素的HPLC-FLD方法，并成功并用于玉米和花生酱中的黄曲霉毒素的分析。

图1. 4种黄曲霉毒素的线性方程及相关系数。

实验部分

仪器及装置

Agilent 1260 Infinity液相色谱系统，包括溶剂架，四元泵（内置脱气机），标准自动进样器，柱温箱，荧光检测器。拜发公司KOBRA电化学衍生装置，包括电化学衍生池、可变控制电源、0.5mm内径PEEK管（至少34cm）等。

HPLC 方法

色谱柱：Zorbax Eclipse Plus C18，4.6mm×150mm×5μm；

柱温：40℃；

流动相A：1L水，加入238mg 溴化钾和700μl 4M硝酸；

流动相B：甲醇；

等度：A/B = 50/50，12min；

流速：1.0ml/min；

检测：荧光, Ex为362nm, Em为455nm，gain=15；

进样量：20μl；

电化学衍生池电流：100μA；反应管：0.5mm i.d×34cm PEEK管（从衍生池出口到荧光检测器入口）。

图2. 6针10μg/L 黄曲霉毒素混标连续进样色谱图（左）和0.1μg/L 混标色谱图（右）。

样品前处理方法

称取25g待测样品于高速匀质器中，加入2g氯化钠和125ml甲醇/水（60/40, V/V），高速搅拌匀质1min后，加入125ml去离子水稀释提取液。手动混合均匀后，立即取40~50ml该提取液过Whatman No.4滤纸，取滤液10ml（相当于1g样品）上样于预先活化好的AFLAPREP免疫亲和柱（活化程序参考亲和柱说明书），以2~3ml/min流速流过免疫亲和柱，再用10ml去离子水冲洗免疫亲和柱并抽至近干。精密移取1 ml甲醇于免疫亲和柱，以手动方式，用2ml注射器将甲醇缓慢推过免疫亲和柱（必要时，可用甲醇反冲免疫亲和柱以保证黄曲霉毒素完全洗脱），完全收集洗脱液，并用1ml去离子水稀释洗脱液，混匀后过0.22μm滤膜，待测。

图3. 玉米样品（左）和花生酱样品（右）色谱图。

方法线性范围、检出限和精密度

分别配制0.1、0.25、0.5、1.0、5.0、10.0μg/L 四种黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的混合标准溶液（稀释剂为MeOH/H2O =50/50），按上述HPLC 方法分析，以峰面积对浓度作图，得出四种黄曲霉毒素的线性拟合曲线相关系数R2>0.99998，线性拟合方程见图1。按信噪比S/N=3计算，得出B1、B2、G1和G2的检出限分别为0.007、0.004、0.006和0.005μg/L，连续6次10μg/L标准混合溶液考察方法精密度，得出4种黄曲霉毒素峰面积RSD<0.3%，保留时间RSD<0.1%。6针10μg/L标准混合溶液叠加色谱图和0.1μg/L混标色谱图如图2所示。表1 比较了本文方法和常见标准方法的检出限，发现本文方法可完全满足现行国内外标准的要求。

小结

本文通过柱后电化学衍生-荧光检测方法，进一步提高了黄曲霉毒素G1和B1的检出限。在保证4种黄曲霉毒素分离度的前提下，将黄曲霉毒素的保留时间缩短至8min之内（为保证样品组分完全洗脱，实际样品分析时间为12min）。同时为去除样品中干扰组分，采用免疫亲和柱净化样品，效果明显。实验证明，该方法可用于实际样品中痕量黄曲霉毒素的准确测定。

内容来源：安捷伦科技有限公司

责任编辑：展源

审　　核：何发