摘　要:采用荧光猝灭光谱、同步荧光光谱研究了核黄素与牛血清白蛋白(BSA) 相互作用的光谱行为。结果发现,在温度为293 K 和310 K 时核黄素与BSA 的结合常数( Kb ) 分别为4. 879 ×105 L•mol- 1 和1. 880 ×105 L•mol- 1 ,结合热力学方程计算得到了对应温度下的热力学参数。结果表明核黄素对BSA 有较强的荧光猝灭作用,其荧光猝灭过程属于动态猝灭机制,二者主要靠疏水作用力结合。采用同步荧光光谱探讨了核黄素对BSA 构象的影响。

关键词:核黄素;牛血清白蛋白;荧光光谱

中图分类号:O657. 39 　　文献标识码:A 　　　文章编号:100626144 (2010) 0120067204

血清白蛋白是人和动物血清中含量最丰富的一种蛋白质,与各种带正负电荷的物质及电中性物质均有一定程度的相互作用。各种药物进入体内首先与血清白蛋白结合,通过血浆的存储和运输,到达受体部位产生药理作用[ 1 ] 。测定血清白蛋白的变化,可为疾病诊断、疗效观察提供有价值的资料及数据。因此,从不同角度研究以白蛋白为代表的蛋白质与具有生物活性小分子间的相互作用,对了解药物的作用机制具有重要意义。通过对荧光光谱的研究,可以获得蛋白质分子中荧光生色基团的种类、结构和所处微环境及其分布情况等有用信息,同时还可以得到外源物质与生物大分子相互作用的有关数据。目前已有多篇文献采用荧光光谱法研究药物分子如槲皮素[3 ] 、甲基硫菌灵[4 ] 等与血清白蛋白的相互作用。

核黄素(Riboflavin ,RI) 又称维生素B2 ,是人体必需的13 种维生素之一,具有促进发育和细胞的再生;促使皮肤、指甲、毛发的正常生长;消除口腔内、唇、舌的炎症;减轻眼睛的疲劳增进视力,协助代谢碳水化合物、脂肪、蛋白质等多种功能。同时还具有利尿消肿,防治肿瘤,降低心脑血管病的发生等保健功效。

本文采用荧光光谱法研究了核黄素与牛血清白蛋白(BSA) 间的相互作用,探讨了核黄素与BSA 作用机制,计算得到荧光猝灭常数,以及与BSA 作用的结合常数和结合位点数等信息。

1 　实验部分

1. 1 　试剂与仪器

RF25301 型荧光分光光度计(日本,岛津公司) ;UV28453 型紫外分光光度计(日本,日立公司) ; TB285型恒温水浴(日本,岛津公司) ;p HSJ24A p H 计(上海雷磁仪器厂) 。

牛血清白蛋白(Amresco. 0930 ,分子量:65 000) ;核黄素(中国药品生物制品检定所) ;p H = 7. 40 的Tris2HCl 缓冲溶液;以Tris2HCl 缓冲溶液为溶剂配制1. 0 ×10 - 3 mol•L - 1 的BSA 标准溶液,1. 0 ×10 - 3mol•L - 1 核黄素标准溶液,两种标准溶液均在0～4 ℃冰箱中保存。实验所需浓度由此稀释而得。Tris ,HCl ,NaCl均为分析纯;水为双重蒸馏水_。

1. 2 　实验方法

在10 mL 比色管中依次加入p H = 7. 40 的Tris2HCl 缓冲溶液2 mL ,1. 0 ×10 - 3 mol/ L BSA 溶液0. 5mL 以及一定量核黄素溶液,用0. 1 mol/ L NaCl水溶液稀释至刻线后混匀,在实验温度下恒温1 h ,采用1 cm石英池,激发波长为285 nm ,绘制300～450 nm 的荧光光谱,并分别以△λ= 60 nm 和△λ= 15 nm 扫描其同步荧光光谱,测定时入射狭缝均为10 nm ,出射狭缝均为5 nm。

2 　结果与讨论

2. 1 　荧光猝灭光谱

按照实验方法测定不同温度条件下BSA 溶液中加入不同量核黄素的荧光光谱(图1) 。

由于蛋白质中存在色氨酸和酪氨酸,使其具有内源荧光,由图1 可知:当固定BSA 的量,随着核黄素浓度的增加,BSA 的荧光强度不断降低,荧光峰逐渐蓝移,说明核黄素与BSA 发生了相互作用,这种作用可能引起BSA 中荧光发色团的微环境及蛋白质分子构象行为的变化[5 ] 。进一步研究发现在293 K 和310 K条件下加入核黄素的浓度与BSA 荧光猝灭值△F( △F = F0 - F, F、F0 分别指有无RI 时的荧光强度) 分别在0～0. 6 ×10 - 5 mol/ L 、0～0. 4 ×10 - 5 mol/ L 范围内呈良好的线性关系,回归系数R 分别为0. 9982 、0. 9938 ,该法可用于核黄素浓度的测定。

2. 2 　荧光猝灭机理及结合常数的基本确定

引起BSA 荧光猝灭的原因可能有动态猝灭和静态猝灭两种。动态猝灭过程遵循Stern2Volmer 方程[6 ] 。

F0 / F = 1 + KSV [Q ] = 1 + Kq∈0 [Q ] (1)

式中, F0 和F 分别表示不存在和存在猝灭剂物质的荧光强度; [Q ]为猝灭剂的浓度, KSV为动态猝灭常数,Kq是由扩散过程控制的双分子动态猝灭速率常数[7 ] 。∈0 为没有猝灭剂存在下荧光分子平均寿命,生物大分子荧光寿命约为10 - 8 s[8 ] 。而静态猝灭过程遵循下式:

F0 / F = 1 + KS [Q ] (2)

式中, KS 是静态猝灭常数。随温度的升高动态猝灭常数会增大,而静态猝灭常数随之减小,可由此判断荧光猝灭类型。

根据Stern2Volmer 方程绘制不同温度下的( F0 / F - 1) ～[Q ]曲线,结果显示,随温度升高曲线斜率增大,表明猝灭机理为动态猝灭。表1 为不同温度核黄素对BSA 荧光猝灭的Stern2Volmer 方程及猝灭常数。各类猝灭剂对生物大分子的最大动态猝灭速率常数约为2 ×1010 L•mol- 1 •s - 1 ,而从表1 结果来看,Kq数量级在1013 ( Kq= KSV /∈0 ) ,由此可知,猝灭机理似乎应为静态猝灭,但考虑到离子强度是影响猝灭系数的重要因素,实验采用0. 1 mol•L - 1NaCl 以控制溶液离子强度,我们认为Kq的增大可能是离子强度影响的结果[9 ] 。

为验证核黄素对BSA 荧光的猝灭机理,测定了1. 0 ×10 - 5 mol•L - 1 BSA (以去离子水为参比) 和核黄素与BSA等摩尔混合物的吸收光谱图(以核黄素溶液作参比) ,两者几乎完全重合,表明核黄素的加入并未使BSA 的紫外吸收光谱发生变化。进一步证实核黄素对BSA 荧光猝灭机理是其与BSA 激发态分子生成瞬时的激发态复合物的动态猝灭过程而不是与BSA 在基态时生成不发光的配合物所产生的静态猝灭过程[10 ] 。

2. 3 　BSA 与核黄素结合反应的热力学性质及作用力

分子间的作用力包括氢键,范德华力,静电引力,疏水作用力等。当温度变化不大时,反应的焓变△r Hm可认为是常数。由热力学公式In ( K2 / K1 ) = △r Hm(1/ T1 - 1/ T2 ) R ; △r Gm= RTInK; △rSm =( △r Hm- △r Gm) / T。分别计算出温度为293 K,310 K 时,核黄素与BSA 作用的自由能变△r Gm、焓变△r Hm和熵变△r Sm分别为- 28. 80 kJ •mol- 1 ,4. 406 kJ •mol- 1 ,0. 113 kJ •mol- 1 及- 30. 732 kJ •mol- 1 ,4. 406 kJ •mol- 1 ,0. 113 kJ•mol- 1 。

核黄素与BSA 的热力学参数△r Hm> 0 和△r Sm> 0 ,根据Ross 等总结出的判断生物大分子与小分子结合力性质和生物大分子自身结合力性质的热力学规律[11 ] 推断出核黄素与BSA 之间的主要作用力是疏水作用。

2. 4 　核黄素与BSA 的表观结合常数Kb 以及结合位点数n

当小分子与大分子结合时其表观结合常数Kb 与结合位点数n 由下式求出:

lg[ ( F0 - F) / F] = lgKb + nlg[Q ]

分别在293 K, 310 K温度下做lg ( F0 - F) / F - lg[Q ]的双对数图,根据截距和斜率求得不同温度的Kb 和n ,如表2 。

由表2 可知,在293 K、310 K核黄素与BSA 的n 接近1 , Kb 值为105 数量级,说明核黄素与BSA 具有一个结合位点数。核黄素与BSA 有较强的结合作用可以被蛋白质运输和储存。

2. 5 　同步荧光光谱

△λ= 15 nm 的同步荧光光谱只显示酪氨酸残基的光谱特征, △λ= 60 nm 的同步荧光光谱仅显示色氨酸残基的光谱特征[12 ] 。图2 为固定BSA 浓度改变核黄素浓度所做的同步荧光光谱图。由图可知酪氨酸残基,色氨酸残基特征荧光光谱峰均随着核黄素浓度增加产生猝灭,同时峰位值均发生了红移,说明酪氨酸残基,色氨酸残基所处的微环境疏水性降低,亲水性增强。色氨酸残基的荧光降低比酪氨酸残基更显著且与BSA 的荧光性质相近,说明BSA 的荧光主要由色氨酸残基所贡献,核黄素与BSA 的结合位点更接近于色氨酸残基。